Биологические объекты животного происхождения в биотехнологии. Основные объекты и методы биотехнологических исследований. Типы и функции генов

В химико-биологических процессов относятся те из них, в которых используют биологические объекты различной природы (микробной, растительной или животной), например, при производстве продукции различного назначения

Антибиотиков, вакцин, ферментов, кормового и пищевого белка, гормонов, аминокислот, био-газа, органических удобрений и т.п..

Объекты биотехнологии очень разнообразны и диапазон их распространяется от организованных частей (вирусов) до человека (рис. 1.1.).

Биообъекты характеризуются такими показателями, как уровень структурной организации, способность к размножению (или репродукции), наличие или отсутствие собственного метаболизма при культивировании в надлежащих условиях. Что касается характера биообъектов, то под этим следует понимать их структурную организацию. В таком случае биообъекты могут быть молекулами (ферменты, иммуномодуляторы, нуклеозиды, олиго-и полипептиды и др.), организованными частями (вирусы, фаги), одноклеточными (бактерии, дрожжи) и многоклеточными особями (нитчатые высшие грибы, растительные ткани, однослойные культуры клеток млекопитающих), целыми организмами растений и животных. Но даже при использовании биомолекулы как объекта биотехнологии ее первоначальный биосинтез осуществляется в большинстве случаев соответствующими клетками. Следовательно, можно утверждать, что объекты биотехнологии принадлежат или к микробам, или в растительных и животных организмов.

Таким образом, независимо от систематического положения биообъектов на практике используют или естественные организованы частицы (фаги, вирусы) и клетки с естественной генетической информацией, или клетки с искусственно заданной генетической информации, то есть в любом случае используют клетки - то микроорганизм, растение, животное или человек. Сейчас большинство объектов биотехнологии составляют микробы, мир которых очень велик и разнообразен. К ним относятся все прокариоты - бактерии, актиномицеты, риккетсии, сине-зеленые водоросли и часть эукариот - дрожжи, нитчатые грибы, простейшие и водоросли (рис. 1.2). Микробами среди растений есть микроскопические водоросли, а среди животных - микроскопические простейшие. Основой современного биотехнологического производства является микробиологический синтез, т.е. синтез различных веществ с помощью микроорганизмов. Объекты растительного и животного происхождения еще не нашли широкого распространения из-за высокой требовательности к условиям культивирования, что значительно здо-рожчуе производство.

Для реализации биотехнологических процессов важными параметрами биообъектов являются: чистота, скорость размножения клеток и репродукции вирусных частей, активность и стабильность биомоле-кул или биосистем.

При использовании ферментов (в изолированном или иммобилизованных состоянии) как биокатализаторов возникает необходимость охраны их от деструкции банальной сапрофитной микрофлорой, которая может проникать в сферу биотехнологического процесса извне вследствие нестерильности системы, например, из-за негерметичности оборудования. Скорость размножения клеток и репродукция вирусных частей прямо пропорционально отражаются на увеличении биомассы и образовании метаболитов.

Активность и стабильность пребывания биообъектов в активном состоянии - важнейшие показатели их пригодности для длительного использования в биотехнологии.

Главным звеном биотехнологического процесса, определяет его сущность, является клетка. Именно в ней синтезируется целевой продукт. По меткому выражению Овчинникова Ю.А. (1985), клетка - это миниатюрный химический завод, который работает с колоссальной производительностью, с предельной согласованности и по заданной программе. В ней ежеминутно синтезируются сотни сложных соединений, включая гигантские биополимеры, в первую очередь белки.

Методы биотехнологии. Биотехнологии присущи свои специфические методы. Это крупномасштабное глубинное культивирование биообъектов в периодическом, полунепрерывного или непрерывном режиме и выращивания клеток растительных и животных тканей в особых условиях. Биотехнологические методы культивирования биообъектов выполняются в специальном оборудовании, например, в ферментерах выращивают бактерии и грибы при получении антибиотиков, ферментов, органических кислот, некоторых витаминов и т.п..

В подобных ферментерах выращивают некоторые клетки человека (бласты) для получения белка-интерферона, а также некоторые виды растительных клеток. Однако последние чаще выращивают в стационарных условиях на среде с уплотненной (например, агар-зированный) подкладкой в стеклянных или полиэтиленовых емкостях.

Другие методы, используемые в биотехнологии, являются общими, например с методами в микробиологии, биохимии, органической химии и других науках. Особенно нужно выделить методы клеточной и генетической инженерии, лежащие в основе современной биотехнологии.

Отличием методов, используемых в биотехнологии, является то, что они должны выполняться, как правило, в асептических условиях (от греческого а - нет, septicos - гнилостный), т.е. с исключения возможности попадания в среду, где культивируется биообъектов, патогенных и сапрофитных микроорганизмов.

Патогенные виды представляют непосредственную опасность для за-деяний в производстве людей и для потребителей конечных продуктов; сапрофитные виды могут выступать конкурентами за питательные субстраты, антагонистами, продуцентами токсических веществ, включая пирогены.

Объекты биотехнологии. Вирусы. Эубактерии. Грибы. Лишайники. Растения. Животные. Строение животной и растительной клетки.

Биотехнологические объекты находятся на разных ступенях организации:

а) субклеточные структуры (вирусы, плазмиды, ДНК митохондрий и хлоропластов, ядерная ДНК);

б) бактерии и цианобактерии;

г) водоросли;

д) простейшие;

е) культуры клеток растений и животных;

ж) растения – низшие (анабена-азолла) и высшие – рясковые.

Объектами биотехнологии являются различные представители живой природы, которые делятся на три надцарства: акариоты (безъядерные), прокариоты (предъядерные) и эукариоты (ядерные) и 5 царств: вирусы, бактерии, в том числе микроскопические водоросли, грибы, а также растения и животные, в том числе простейшие.

Грибы , насчитывающие десятки тысяч видов, сочетают в себе черты клеток растений и животных. Они имеют клеточное ядро, как и растения – прочную клеточную стенку; аналогично клеткам животных они нуждаются в некоторых витаминах и способны синтезировать свойственные животным полисахариды: хитин и гликоген. Наибольший интерес для биотехнологии представляют микроскопические грибы, к которым относятся дрожжи, плесневые и другие микроорганизмы, применяемые в хлебопечении, пивоварении и в молочной промышленности. Они используются также для получения спиртов, органических кислот, антибиотиков, различных биологически активных веществ и кормового белка.

Самостоятельную группу организмов, представляющих собой симбиоз (сожительство) грибов с водорослями или с цианобактериями, составляют лишайники, которые являются перспективными источниками ряда биологически активных веществ.

Растения, насчитывающие около 500000 видов, состоят из ядерных клеток, которые имеют сложное строение и выполняют различные специализированные функции. К ним относятся водоросли, являющиеся водными организмами, и высшие растения, обитающие преимущественно на суше. Водоросли отличаются от высших растений тем, что не имеют органов и тканей, а представляют собой слоевища, состоящие из недифференцированных (одинаковых) клеток. Как и другие растения, водоросли обладают способностью к фотосинтезу и богаты различными углеводами и пигментами. Один из видов водорослей – морская капуста используется в пищу. Из водорослей добывают агар-агар и альгинаты – полисахариды, используемые для изготовления микробиологических сред, в пищевой промышленности, косметологии.

Высшие растения – многоклеточные организмы, имеющие специализированные органы, такие как корни, стебли, листья. Они состоят из тканей, образованных дифференцированными клетками. Ткани различаются химическим составом, строением и выполняют различные функции: механические, покровные, выделительные, проводящие и другие. Особое значение для биотехнологии имеет одна из тканей растений, называемая меристемой. Клетки меристемы способны к делению, благодаря чему осуществляется рост, а также образование тканей и органов растений. Они не утрачивают способности делиться и после удаления из растения. При выращивании на специальных питательных средах клетки меристемы дают массу делящихся клеток – каллус, который можно длительно культивировать, получать из него новые растения или использовать для извлечения нужных веществ. Наиболее сложным, но более эффективным, является выращивание отдельных растительных клеток в жидких средах (в суспензионных культурах). Благодаря способности растений улавливать световую энергию солнца и использовать ее в синтезе органических веществ, растения служат поставщиками питательных веществ для других организмов. Растения составляют большую часть биомассы Земли, поэтому производство и переработка растительного сырья для удовлетворения различных потребностей человека используется с древнейших времен. Являясь богатым и незаменимым источниками разнообразных углеводов, липидов, витаминов и многих других физиологически активных и лекарственных веществ, растения служат прежде всего для их получения. Не смотря на выдающиеся достижения биотехнологии, используются традиционные способы извлечения биогенных соединений: экстракция, перегонка, фильтрация. Все большую роль приобретают технологии получения биологически активных веществ из клеточных культур (биостимуляторы из женьшеня, противораковое средство таксол из коры тиса и др.), а также производство продуктов из генетически модифицированных растений.

Клетки растений и животных являются сложно организованными образованиями, состоящими из цитоплазмы и более плотного ядра. В цитоплазме содержатся внутриклеточные органеллы: митохондрии, рибосомы и лизосомы, шороховатые и гладкие мембраны эндоплазматической сети, погруженные в водорастворимую среду клетки – цитозоль. Клетка окружена плазматической мембраной, обладающей избирательной проницаемостью благодаря наличию специальных механизмов транспорта веществ. Клеточные ядра служат для хранения генетической информации, носителем которой является ДНК.

Митохондрии снабжают клетку энергией за счет окисления веществ, при участии кислорода. В них синтезируются также собственные белки митохондрий. Это – исключение из общего правила. Все остальные клеточные белки синтезируются на рибосомах.

С мембранами эндоплазматической сети связан аппарат Гольджи, представляющий собой систему микротрубочек. В аппарате Гольджи происходят реакции химической модификации белков, а также синтез резервных и секретируемых из клетки веществ.

Жидкая часть клетки – цитозоль содержит ферменты синтеза и анаэробного окисления веществ, а также низкомолекулярные органические и неорганические соединения.

Особенностью строения растительных клеток является наличие хлоропластов, в которых происходят процессы фотосинтеза. От клеток животных растительная клетка отличается также твердой стенкой, в состав которой входят вещества полисахаридной природы (целлюлоза, гемицеллюлозы, пектины) и полифенольный полимер лигнин.

Объекты биотехнологии

Биология в последние десятилетия из науки, имевшей чис­то теоретический интерес, превратилась в науку, практичес­кую значимость которой трудно переоценить. Наблюдается четкая тенденция к «биологизации» промышленности. Биотех­нология становится одним из приоритетных направлений на­учно-технического прогресса. Широкие практические возмож­ности биотехнологии обусловили резкое увеличение числа изобретений, касающихся различных биологических объектов,

От способов лечения людей с помощью генной инженерии до способов охраны окружающей среды.

Достижения в области биотехнологии в настоящее время могут охраняться как предварительными патентами и патента­ми на изобретения, так и патентами на сорта растений и поро­ды животных. Возможна также охрана вкачестве ноу-хау, а также с помощью товарных знаков и норм авторского права.

Патенты становятся все более важным инструментом в деле «коммерциализации» биологии и биотехнологии, а также ору­дием в борьбе за рынки сбыта биотехнологической продукции. Вопрос о защите биотехнологических изобретений продолжа­ет дискутироваться как на национальных, так и международ­ном уровнях.

К объектам изобретений в области биотехнологии согласно пп. 9, 10 «Инструкции по составлению, подаче и рассмотрению заявки на выдачу предварительного патента и патента на изоб­ретение и заявки на выдачу патента на полезную модель» от­носят штаммы микроорганизмов, клеток растений и животных и продукты генной инженерии, которые условно отнесены к веществам (индивидуальным соединениям). Учитывая специ­фику этих изобретений и большое количество специальных терминов, без которых невозможно понимание сути предмета, необходимо дать некоторые разъяснения.

Названные объекты могут быть как живыми штаммы, так и неживыми -вещества. Живые объекты:

Индивидуальные штаммы микроорганизмов.

Индивидуальные штаммы клеток растений и животных,

Консорциумы микроорганизмов, культур клеток расте­ний и животных.

Неживые объекты:

Соединения, полученные биотехнологическим путем, - антибиотики, ферменты, вакцины и т.д.;

Продукты генной инженерии - ДНК- и РНК-последовательности, гены, плазмиды, векторы, белки и т.д.

К области биотехнологии также относятся различные спо­собы с использованием штаммов микроорганизмов, штаммов клеток растений и животных, антибиотиков, нуклеиновых кис­лот, способы производства вакцин и т.д.

Термин «штамм» означает чистую одновидовую культуру микроорганизмов, выделенную из определенного источника или полученную искусственно (в результате мутации) и обла­дающую специфическими физиолого-биохимическими призна­ками.

Понятие «микроорганизм» не имеет точного таксономичес­кого значения (т.е. не относится к какому-либо определенно­му таксону-роду, семейству, виду и т.д.). Оно предполагает, что любой организм микроскопических размеров относится к микроорганизму. Однако это понятие довольно условно, т.к. среди объектов, традиционно считаемых микроскопическими, известны и макроскопические, а размеры одного и того же штамма могут значительно варьироваться в зависимости от условий культивирования и других факторов.

Объект «штамм» для целей патентной процедуры включает любые жизнеспособные организмы микроскопических разме­ров - бактерии, вирусы, простейшие, микроскопические бес­позвоночные животные и др. индивидуальные штаммы, кон­сорциумы микроорганизмов, а также культивируемые сомати­ческие клетки растений и животных. Штамм может быть объек­том правовой охраны только в том случае, если у него выявле­ны какие-либо практические (полезные) свойства. Не являет­ся объектом охраны новый штамм, охарактеризованный с научной точки зрения определенным набором признаков.

К индивидуальным штаммам относят одновидовую куль­туру микроорганизмов.

В понятие «консорциум» сходят псе формы сообществ мик­роорганизмов, т.е. как искусственно составленных смешанных культур, так и культур, выделенных из природных источников как функционально неделимое целое. Использование консор­циумов имеет ряд преимуществ. Например, наиболее стойкие пестициды быстрее и полнее разлагаются не чистыми культу­рами (индивидуальными штаммами), а специально адаптиро­ванными сообществами. Производства, основанные на приме­нении микробных сообществ, в десятки раз превосходят по экономической значимости производства, основанные на чис­тых культурах. Затраты па фундаментальные исследования чистых культур в десятки и сотни раз превосходят затраты на изучение промышленного применения микробных сообществ и т.д.

Клетки растении и животных - совокупность клеток, вы­ращенных вне организма, используемых для селекционной ра­боты в качестве продуцентов каких-либо веществ, для культи­вирования вирусов с целью получения вакцин и т.д.

Следует сказать, что употребление термина «штамм» в па­тентной практике несколько иное, чем в биологии, т.к. биоло­ги на практике обычно не употребляют термин «штамм» в от­ношении большинства перечисленных выше микроорганизмов. Но понятие «штамм» для целей патентной процедуры не про­тиворечит понятию штамм, принятому в биологии. Употреб­ление этого термина в патентной области связано с попыткой унификации множества биологических объектов как объектов изобретения.

В правиле 28 Европейской патентной конвенции до 1995 г. вместо слова «штамм» употреблялось понятие «микроорганизм» с тенденцией к толкованию «размножающийся биологическим путем материал». В дополнительной редакции этого правила, вступившего в силу с I октября 1996 г., понятие «микроорга­низм» заменено понятием «биологический материал». Этот же термин использован и в Директиве ЕС «О правовой охране био­технологических изобретений». Под биологическим материа­лом понимается любой материал, содержащий генетическую информацию, которая является само воспроизводимой или вос­производимой в биологической системе.

Термин же «биологический материал» существенно расши­ряет перечень биологических объектов, которые являются (и могут являться будущем) объектами изобретения и более точ­но отражает природу (существо) объекта.

К соединениям, полученным биотехнологическим путем, как было сказано ранее, относятся антибиотики, ферменты. вакцины и т.д.

Антибиотики - это вещества биологического происхожде­ния, способные увивать микроорганизмы или угнетать их рост, а также рост злокачественных опухолей. Применяются в ме­дицине, сельском хозяйстве, пищевой и микробиологической промышленности. Антибиотики получают как микробиологическим, так и химическим синтезом.

Ферменты (энзимы) - биологические катализаторы, по хи­мической природе белки. Обязательно присутствуют во всех клетках организма. Ускоряют превращения веществ (биохими­ческие реакции), направляют и регулируют обмен веществ.

Вакцины - препараты из живых или мертвых микроорганиз­мов, отдельных компонентов микробных клеток, продуктов жизнедеятельности микроорганизмов. Применяются для про­филактики и лечения человека и животных.

К объектам генной инженерии, если конкретизировать пе­речисленные ранее большие группы объектов, относятся сле­дующие:

ДИК- и РНК-последовательности являются нуклеиновыми кислотами - ДНК (дезоксирибонуклеиновая) и РНК (рибо­нуклеиновая), сложными органическими соединениями. Они могут находиться в ядре клетки, в цитоплазме, в ее органоидах (структурах, имеющихся в цитоплазме). Нуклеиновые кислоты состоят из нуклеотидов, соединенных между собой в цени в определенной последовательности. Главная функция нуклеи­новых кислот - хранение и передача генетической информации.

Гены (фрагменты нуклеиновых кишат)-это участки моле­кул ДНК (высшие организмы) или РНК (вирусы). Гены состоят из нуклеотидов (сложных органических соединений), соеди­ненных между собой и составляющих каждую из цепей ДНК (РНК). Каждый ген включает сотни нуклеотидов и отвечает за синтез определенного белка. Контролируя образование белков, гены управляют всеми химическими реакциями организма и поэтому определяют его признаки.

Рекомбинатные молекулы нуклеиновых кислот новые (ис­кусственно созданные) последовательности нуклеиновых кислот, образованные путем встраивания а цепь чужеродных мо­лекул ДНК.

Плазмида - молекула ДНК, способная к автономной реп­ликации, тек удноению генетического материала.

Вектор- молекула ДНК, способная включать в себя чуже­родную ДНК, проникать в клетку и передавать ей генетичес­кую информацию, которую несет эта чужеродная ДНК. Но передача генетической информации не является единственной функцией вектора, например, существуют векторы, обеспечи­вающие реализацию генетической информации и т. д.

Белки - высокомолекулярные органические соединения. состоящие из аминокислот и участвующие в построении кле­ток и тканей, являющиеся ферментами, гормонами, дыхатель­ными пигментами (гемоглобин) и т.д.

1.6.2. Особенности описания объектов биотехнологии при составлении заявки на изобретение

Разделы описания для объектов в области биотехнологии имеют ту же последовательность и структуру, что и для тради­ционных (устройство, способ, вещество, применение извест­ных объектов, по новому назначению). Однако есть ряд осо­бенностей, которые даются ниже. Нет необходимости приво­дить подробную информацию об описании объектов, поэтому эти сведения дают только общее представление о характере информации. Подробное описание объектов приводится в Ин­струкции, и при составлении заявки следует руководствовать­ся этим нормативным документом и как дополнением - «Ре­комендациями по составлению заявок на выдачу предваритель­ного патента и патента на изобретение в области медицины, биологии и сельского хозяйства», изданными в 2002 г.

При описании штаммов микроорганизмов, клеток растений и животных указывают номенклатурные данные, происхожде­ние штамма, количественный и качественный состав питатель­ных сред, условия культивирования, сведения о биосинтезе, по­лезных (целевых) продуктах, уровне активности штамма, де­понировании (более подробная информация о депонировании приведена ниже) и др.

Для консорциумов микроорганизмов, клеток растений и животных указывают метод проверки наличия компонентов (микроорганизмов, уходящих в состав консорциума), способы их выделения, стабильность консорциума, сведения о депони­ровании и т.д.

Формула изобретения на штамм микроорганизма, клеток метений и животных включает видовое и родовое название биологического объекта, название или аббревиатуру коллекции-депозитария, регистрационный номер, присвоенный кол­лекцией депонированному объекту, и назначение штамма. На­пример:

«Штамм дрожжей Rhodotoruia giutinis ВКПМ У-2230продуцент каротиноидов»;

- «Консорциум штаммов бактерий Pseudomonas species ВКПМ В-6782, Pseudomonas pseudoaicaJigenes ВКПМ В-6783, Corynebacterium species DRCJV D-6784. разлагающий продук­ты переработки нефти»;

- «Штамм культуры клеток человека НТНIV 27 ГКВ № 4122- продуцент вируса иммунодефицита человека».

Для соединений, полученных биотехнологическим путем, приводимые в описании сведения зависят от объекта. Напри­мер, если последний относится к соединениям с неустановлен­ной структурой, то необходимы данные для отличия этого со­единения от других. Если речь идет об индивидуальных соеди­нениях, то необходимо привести структурную формулу и т.д. Примеры составления формул приведены при описании объекта «вещество» всоответствующей главе настоящего учебника.

Продукты генной инженерии сравнительно недавно стали рассматриваться как объекты изобретений и поэтому здесь требуются некоторые разъяснения.

Вопрос о том, как охарактеризовать продукты генной ин­женерии, один из наиболее трудноразрешимых. Причина не только и том что это довольно молодая область знаний, но и в специфике продуктов генной инженерии, которая заключает­ся как в их химической природе (отсюда возможность прирав­нивания их к индивидуальным соединениям как объектам ох­раны), так и в том - и это главное, - что они являются носите­лями генетической информации.

Возможность контролированного манипулирования гене­тическим материалом вызывает живой интерес к коммерчес­кому использованию как живых организмов (микроорганиз­мы, растения, животные), так и их элементов (гены, плазмиды. Фрагменты ДНК и т.д.)

Началом современной промышленной генной инженерии принято считать 1980 год, когда был выдан патент на штамм

Предоставление документа о депонировании подразумева­ет, что изобретатель уже доказал существование организма, относящеюся к изобретению, который может быть запрошен и получен заинтересованным лицом и в совокупности с опуб­ликованным описанием делает изобретение доступным обще­ству.

ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЙ БИЛЕТ № 1

Обьекты биотехнологии и их уровни

Биотехнология означает любой вид технологии,связанный с использованием биологических систем, живых организмов или их производных для изготовления или изменения продуктов или процессов с целью их конкретного использования.Биотехнологические ресурсы-это биологические ресурсы,используемые в биотехнологических процессах.

Объекты для производства должны соответствовать определенным требованиям:-способность к росту на дешевых питательных средах.-высокая скорость роста и образования целевого продукта;-минимальное образование побочных продуктов;-стабильность продуцента и отношении производственных свойтв;-безвредность продуцента и целевого продукта для человека и окружающей среды.Важным свойством биообъекта является устойчивость к ифекции,что важно для поддержания стерильности и фагоустойчивость. Функции биообъекта заключаются в полном биосинтезе целевого продукта, вклющающий ряд последовательных ферментативных реакций или катализ лишь одной ферментативной реакции,которая имеет ключевое значение для получения целевого продукта.

Объекты биотехнологии очень разнообразны и диапазон их распространяется от организованных частей (вирусов) до человека Биообъект,осуществлящий полный биосинтез целевого продукта.называется продуцентом.Биообъект,являющийся индивидуальным ферментом,используемой биотехнологом, называют промышленным биокатализатором.

б) бактерии и цианобактерии;

г) водоросли;

д) простейшие;

ж) растения – низшие (анабена-азолла) и высшие – рясковые.

В таком случае биообъекты могут быть молекулами (ферменты, иммуномодуляторы, нуклеозиды, олиго-и полипептиды и др.), организованными частями (вирусы, фаги), одноклеточными (бактерии, дрожжи) и многоклеточными особями (нитчатые высшие грибы, растительные ткани, однослойные культуры клеток млекопитающих), целыми организмами растений и животных. Но даже при использовании биомолекулы как объекта биотехнологии ее первоначальный биосинтез осуществляется в большинстве случаев соответствующими клетками. Следовательно, можно утверждать, что объекты биотехнологии принадлежат или к микробам, или в растительных и животных организмов.

Какими способностями обладают клетки организмов?

Клетка - элементарная биологическая система, способная к самообновлению, самовоспроизведению и развитию. Клеточные структуры лежат в основе строения растений и животных. Каким бы многообразным ни представлялось строение организмов, в основе его лежат сходные структуры - клетки.
Клетка обладает всеми свойствами живой системы:
осуществляет обмен веществом и энергией;
растет;
размножается и передает по наследству свои признаки;
реагирует на внешний сигналы (раздражители) ;
способна передвигаться.
Она является низшей ступенью организации, обладающей всеми этими свойствами, наименьшей структурной и функциональной единицей живого. Она может жить и отдельно: изолированные клетки многоклеточных организмов продолжают жить и размножаться в питательной среде.

Функции в клетке распределены между различными органеллами, такими как клеточное ядро, митохондрии и т. д. Все живые организмы либо, как многоклеточные животные, растения и грибы, состоят из множества клеток, либо, как многие простейшие и бактерии, являются одноклеточными организмами.Одноклеточные организмы - внесистематическая категория живых организмов, тело которых состоит из одной (в отличие отмногоклеточных) клетки (одноклеточность ). К ней могут относиться как прокариоты, так и эукариоты. Считается, что одноклеточными были первые живые организмы Земли. Наиболее древними из них считаются бактерии и археи.Многоклеточный организм - внесистематическая категория живых организмов, тело которых состоит из многих клеток, большая часть которых (кроме стволовых, например, клеток камбия у растений) дифференцированы, то есть различаются по строению и выполняемым функциям. Следует отличать многоклеточность и колониальность . У колониальных организмов отсутствуют настоящие дифференцированные клетки, а следовательно, и разделение тела на ткани. Современная клеточная теория включает следующие положения:
1) клетка - единица строения и развития всех организмов;
2) клетки организмов разных царств живой природы сходны по строению, химическому составу, обмену веществ, основным проявлениям жизнедеятельности;
3) новые клетки образуются в результате деления материнской клетки;
4) в многоклеточном организме клетки образуют ткани;
5) из тканей состоят органы.

Клетки грибов, растений и животных имеют сходное строение. В клетке различают три основные части: ядро, цитоплазму и плазматическую мембрану. Плазматическая мембрана состоит из липидов и белков. Она обеспечивает поступление веществ в клетку и выделение их из клетки. В клетках растений, грибов и большинства бактерий над плазматической мембраной имеется клеточная оболочка. Она выполняет защитную функцию и играет роль скелета. У растений клеточная оболочка состоит из целлюлозы, а у грибов из хитиноподобного вещества. Клетки животных покрыты полисахаридами, обеспечивающими контакты между клетками одной ткани.

ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЙ БИЛЕТ -3

1. Требования предьявляемые к биообьектам? Биообъект -это продуцент, биосинтезирующий нужный продукт, либо катализатор, фермент, который катализирует присущую ему реакцию.

Требования, предъявляемые к биологическим объектам

Для реализации биотехнологических процессов важными параметрами биообъектов являются: чистота, скорость размножения клеток и репродукции вирусных частиц, активность и стабильность биомолекул или биосистем.

Следует иметь в виду, что при создании благоприятных условий для избранного биообъекта биотехнологии эти же условия могут оказаться благоприятными, например, и для микробов – контаминантов, или загрязнителей. Представителями контаминирующей микрофлоры являются вирусы, бактерии и грибы, находящиеся в культурах растительных или животных клеток. В этих случаях микробы-контаминанты выступают вредителями производств в биотехнологии. При использовании ферментов в качестве биокатализаторов возникает необходимость предохранения их в изолированном или иммобилизованном состоянии от деструкции банальной сапрофитной (не болезнетворной) микрофлорой, которая может проникнуть в сферу биотехнологического процесса извне вследствие нестерильности системы.

Активность и стабильность в активном состоянии биообъектов – одни из важнейших показателей их пригодности для длительного использования в биотехнологии.

Таким образом, независимо от систематического положения биообъекта, на практике используют либо природные организованные частицы (фаги, вирусы) и клетки с естественной генетической информацией, либо клетки с искусственно заданной генетической информацией, то есть в любом случае используют клетки, будь то микроорганизм, растение, животное или человек. Для примера можно назвать процесс получения вируса полиомиелита на культуре клеток почек обезьян в целях создания вакцины против этого опасного заболевания. Хотя мы заинтересованы здесь в накоплении вируса, репродукция его протекает в клетках животного организма. Другой пример с ферментами, которые будут использованы в иммобилизованном состоянии. Источником ферментов также являются изолированные клетки или специализированные ассоциации их в виде тканей, из которых изолируют нужные биокатализаторы.

Перечислите генные ресурсы?

Ресурсы биологические - организмы, которые являются или могут быть объектами промысла; все живые средообразующие компоненты биосферы (продуценты, консументы, редуценты). Они относятся к категории исчерпаемых возобновимых природных ресурсов. Различают растительные ресурсы, ресурсы животного мира, охотничьи, пастбищные и др. Особо выделяют генетические ресурсы, т. е. наследственная генетическая информация, заключенная в генетическом коде живых существ.

Развитие биотехнологии тесно связано с использованием генетических ресурсов. Они, как правило, являются уникальной принадлежностью отдельных регионов мира, и на их применении часто основаны вековые традиции и национальные особенности земледелия, животноводства, медицины.

Генетические ресурсы - генетический материал, представляющий фактическую или потенциальную ценность.

В свою очередь, генетический материал определяется как любой материал растительного, животного, микробного или иного происхождения, содержащий функциональные единицы наследственности.

Биологические ресурсы - генетические ресурсы, организмы или их части, популяции или любые другие биотические компоненты экосистем, имеющие фактическую или потенциальную полезность либо ценность для человечества.

Каковы функции биообьектов?

Главным звеном биотехнологического процесса являются биообъекты.

Биообъект - центральный и обязательный элемент биотехнологического производства, создающий его специфику.

Биообъектом может быть целостный сохранивший жизнеспособность многоклеточный или одноклеточный организм. Им могут являться изолированные клетки многоклеточного организма, а также вирусы и выделенные из клеток мультиферментные комплексы, включенные в определенный метаболический процесс. Также биообъектом может быть индивидуальный изолированный фермент.

Функция биообъекта - полный биосинтез целевого продукта, включающий ряд последовательных ферментативных реакций или катализ лишь одной ферментативной реакции, которая имеет ключевое значение для получения целевого продукта.

Доказано, что использование ферментов в производстве в иммобилизованном виде, т.е. связанных с нерастворимым носителем, наиболее рационально, так как в этом случае обеспечиваются многократность их применения и стандартность повторяющихся производственных циклов.

К биообъектам относятся как макромолекулы, так и микро- и макроорганизмы. В качестве макромолекул используются ферменты. Их использование наиболее рационально, так как в этом случае обеспечиваются многократность их применения и стандартность повторяющихся производных циклов.

В качестве биообъектов для приготовления вакцин используются вирусы. Доминирующее положение в современном биотехнологическом процессе занимают микробные клетки эукариот и прокариот. Они являются продуцентами (биообъект, осуществляющий полный биосинтез целевого продукта) используемых в качестве лекарственных средств первичных метаболитов.

Высшие растения являются наиболее обширным источником получения лекарственных средств. При использовании растений в качестве биообъектов основное внимание сосредоточено на вопросах культивирования растительных тканей на искусственных средах.

Биотехнологические объекты находятся на разных ступенях организации:

а) субклеточные структуры (вирусы, плазмиды, ДНК митохондрий и хлоропластов, ядерная ДНК);

б) бактерии и цианобактерии;

г) водоросли;

д) простейшие;

е) культуры клеток растений и животных;

ж) растения - низшие (анабена-азолла) и высшие - рясковые.

Типы и функции ДНК?

Нуклеиновые кислоты

Среди прочих химических веществ ДНК была выделена в отдельную группу в 1869 г. Однако строение и трехмерную структуру ДНК удалось расшифровать английскому ученому Ф.Крику и американскому Дж.Уотсону только в 1953 г. Ими была построена модель ДНК. Она представляет собой двойную спираль, оба тяжа которой скручены вокруг воображаемой оси.

Состоит ДНК из множества единиц дезоксирибонуклеотидов, которые делятся на четыре типа. Они образуют специфические последовательности, характерные для каждого конкретного живого организма. Эти дезоксирибонуклеотиды представляют собой трехкомпонентные образования, которые состоят из гетероциклического основания (пурины - аденин или гуанин, или пиримидины - тимин или цитозин), которые в свою очередь соединяются с дизоксирибозой.

В клетках прокариот содержится одна хромосома, в состав которой входит двойная цепь ДНК. Эукариотические клетки содержат несколько молекул ДНК, которые связаны с белками и организованы внутри ядра. Ядро окружено двухмембранной системой.

Функция ДНК состоит в том, что она хранит генетическую информацию, которая используется для кодирования структуры всех белков и всех видов РНК каждого вида организма, регулирует клеточный и тканевый биосинтез компонентов и обеспечивает индивидуальность каждого организма. Некоторые вирусы также используют ДНК в качестве генетического материала. Вирусные ДНК по размеру меньше, чем ДНК бактерий.

Структура ДНК. В ДНК условно можно выделить первичную, вторичную и третичную структуры.

Первичная структура ДНК – это количество, качество и порядок расположения остатков дезоксирибонуклеотидов в полинуклеотидных цепях.

Вторичная структура ДНК - представляетсобой организацию полинуклеотидных цепей в молекуле ДНК. Молекула ДНК состоит из двух полинуклеотидных цепей, направленных противоположно друг другу и правозакрученых вокруг спиральной оси с образованием двойного типа спирали. Ее диаметр составляет 1,8-2,0 нм с периодом идентичности 3,4 нм.

Углеводно-фосфатные группы в спирали расположены снаружи (сахарофосфатное основание), а азотистые основания - внутри. Азотистые основания двух цепей связываются между собой водородными связями по принципу комплементарности: аденин образует двойную связь с тимином, а гуанин в свою очередь - три связи с цитозином. Двойная спираль - характерное строение для большинства ДНК-молекул. Одноцепную ДНК содержат некоторые вирусы, а также кольцевые формы ДНК - плазмиды.

Третичная структура ДНК - это образование в пространстве спиралевидных и суперспиралевидных форм молекулы ДНК. Третичная структура ДНК (прокариот и эукариот) отличается некоторыми особенностями, которые связаны со строением и функцией клеток. Третичная структура ДНК эукариот образуется благодаря множественной суперспирализации молекулы и реализуется в виде комплексов ДНК с белками.

ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЙ БИЛЕТ № 5_____

Классификация биообъектов

Макромолекулы

Ферменты всех классов (чаще гидролазы и трансферазы); в т.ч. в иммобилизированном виде (связанные с носителем) обеспечивающем многократность использования и стандартность повторяющихся производственных циклов;

ДНК и РНК - в изолированном виде, в составе чужеродных клеток.

Микроорганизмы

Вирусы (с ослабленной патогенностью используются для получения вакцин);

Клетки прокариоты и эукариоты - продуценты первичных метаболитов: аминокислот, азотистых оснований, коферментов, моно- и дисахаров, ферментов для заместительной терапии и т.д.); -продуценты вторичных метаболитов:антибиотики, алкалоиды, стероидные гормоны, и др.;

Нормофлоры - биомасса отдельных видов микроорганизмов применяемые для профилактики и лечения дисбактериозов;

Возбудители инфекционных заболеваний - источники антигенов для производства вакцин;

Трансгенные м/о или клетки - продуценты видоспецифичных для человека белковых гормонов, белковых факторов неспецифического иммунитета и т.д.

Макроорганизмы

Высшие растения - сырье для получения БАВ;

Животные - млекопитающие, птицы, рептилии, амфибии, членистоногие, рыбы, моллюски, человек;

Трансгенные организмы.

Типы и функции РНК?

Одним из важнейших открытий во второй половине двадцатого столетия стали нуклеиновые кислоты РНК и ДНК, благодаря которым человек приблизился к разгадкам тайн природы.

Нуклеиновые кислоты - это органические соединения, обладающие высокомолекулярными свойствами. В их состав входят водород, углерод, азот и фосфор.

Она представляет собой одну полинуклеотидную цепочку (кроме вирусов), которая намного короче, чем у ДНК. Один мономер РНК - это остатки следующих веществ: основания азота; пятиуглеродного моносахарида; кислоты фосфора. РНК имеют пиримидиновые (урацил и цитозин) и пуриновые (аденин, гуанин) основания. Рибоза является моносахаридом нуклеотида РНК.

Клетка РНК впервые была открыта биохимиком из Германии Р. Альтманом при исследовании дрожжевых клеток. В середине двадцатого века была доказана роль ДНК в генетике. Лишь тогда описали и типы РНК, функции.

В зависимости от вида РНК, функции ее также отличаются. Существуют несколько видов:

1) Информационная РНК (и-РНК). Иногда данный биополимер называют матричной РНК (м-РНК). Данный вид РНК располагается как в ядре, так и в цитоплазме клетки. Основное назначение – перенос информации о строении белка от дезоксирибонуклеиновой кислоты к рибосомам, где и происходит сбор белковой молекулы. Относительно небольшая популяция молекул РНК, составляющая менее 1% от всех молекул.

2) Рибосомная РНК (р-РНК). Самый распространенный вид РНК (около 90% от всех молекул данного вида в клетке). Р-РНК расположена в рибосомах и является матрицей для синтеза белковых молекул. Имеет наибольшие, по сравнению с другими видами РНК, размеры. Молекулярная масса может достигать 1,5 миллионов к Дальтон и более.

3) Транспортная РНК (т-РНК). Расположена, преимущественно, в цитоплазме клетки. Основное назначение - осуществление транспорта (переноса) аминокислот к месту синтеза белка (в рибосомы). Транспортная РНК составляет до 10% от всех молекул РНК, располагающихся в клетке. Имеет наименьше, по сравнению с другими РНК- молекулами, размеры (до 100 нуклеотидов).

4) Минорные (малые) РНК. Это молекулы РНК, чаще всего с небольшой молекулярной массой, располагающиеся в различных участках клетки (мембране, цитоплазме, органеллах, ядре и т.д.). Их роль до конца не изучена. Доказано, что они могут помогать созреванию рибосомной РНК, участвуют в переносе белков через мембрану клетки, способствуют редупликации молекул ДНК и т.д.

5) Рибозимы. Недавно выявленный вид РНК, принимающие активное участие в ферментативных процессах клетки в качестве фермента (катализатора).

6) Вирусные РНК. Любой вирус может содержать только один вид нуклеиновой кислоты: либо ДНК либо РНК. Соответственно, вирусы, имеющие в своём составе молекулу РНК, получили название РНК-содержащие. При попадании в клетку вируса данного типа может происходить процесс обратной транскрипции (образование новых ДНК на базе РНК), и уже вновь образовавшаяся ДНК вируса встраивается в геном клетки и обеспечивает существование, а также размножение возбудителя. Вторым вариантом сценария является образование комплиментарной РНК на матрице поступившей вирусной РНК. В этом случае, образование новых вирусных белков, жизнедеятельность и размножение вируса происходит без участия дезоксирибонуклеиновой кислоты только на основании генетической информации, записанной на вирусной-РНК.

Типы и функции генов?

Ген, классификация и организация генов
Генетика изучает универсальные для всех живых организмов закономерности наследственности и изменчивости.
Элементарными дискретными единицами наследственности являются гены . Воспроизведение и действие генов непосредственно связано с матричными процессами. В настоящее время ген рассматривается как единица функционирования наследственного материала. Химической основой гена является молекула ДНК.
Существует несколько подходов к классификации генов, каждый из которых отражает особенности их функционирования в процессе онтогенеза. Гены, как единицы функции наследственного материала, разделяются на структурные, регуляторные и гены-модуляторы.
Структурные гены содержат информацию о структуре белка (полипептидов) и рибонуклеиновых кислот (рибосомальной и транспортной), при этом генетическая информация реализуется в процессе транскрипции и трансляции или только транскрипции.У человека насчитывается около 30 000 структурных генов, но только часть из них экспрессирована.
Жизнедеятельность клеток обеспечивается небольшим набором функционирующих генов, среди них различают гены «домашнего хозяйства» - ГОФ (гены общеклеточных функций)и гены «роскоши» - ГСП (гены специализированных функций). ГОФ обеспечивают осуществление универсальных клеточных функций, которые необходимы для деятельности всех клеток (гены гистонов, гены р-РНК и т-РНК и др.). ГСП: 1- избирательно экспрессируются в специализированных клетках, определяя их фенотип (гены глобинов, иммуноглобулинов и др.); 2 - функционируют при определенных условиях внешней среды и представляют гены “адаптивного ответа”. Принадлежность к ГОФ или ГСП определяется структурой инициатора.
Регуляторные гены (ген - регулятор лактозного оперона, ген TFM и др.) координируют активность структурных генов на уровне клетки, а также дерепрессию и репрессию генов на уровне организма. Наряду с регуляторными генами, имеются регуляторные последовательности (промотор, оператор, терминатор, энхансеры, сайленсеры, элемент перед промотором), функция которых выявляется во взаимодействии со специфическими белками.
Гены-модуляторы усиливают или ослабляют действие структурных генов, изменяя их функциональную активность.
Структурные гены различным образом организованы у прокариот и эукариот.
У прокариот структурные гены организованы в виде независимых генов, транскрипционных единиц и оперонов.
Независимые гены состоят из непрерывной последовательности кодонов, они постоянно экспрессированы и не регулируются на уровне транскрипции (ген-регулятор лактозного оперона). Транскрипционные единицы - группы разных генов, которые связаны функционально и транскрибируются одновременно, что обеспечивает в последующем одинаковое количество синтезируемых продуктов. Обычно это гены белков или нуклеиновых кислот (у кишечной палочки в составе одного из транскриптонов находятся два гена т-РНК, три гена р-РНК).
Оперон - это группа структурных генов, следующих друг за другом, находящихся под контролем оператора - определённого участка ДНК.
Структурные гены имеют общий промотор, оператор и терминатор, участвуют в одном метаболическом цикле и регулируются координированно
У эукариот структурные гены, функция которых связана с регуляторными, организованы в виде независимых генов, повторяющихся генов и кластеров генов.
Независимые гены, как правило, располагаются индивидуально, их транскрипция не связана с транскрипцией других генов. Активность некоторых из них регулируется гормонами.
Повторяющиеся гены присутствуют в хромосоме в виде повторов (копий) одного гена - гены гистонов, тРНК, рРНК. Причина повторяемости гистоновых генов определяется необходимостью синтезировать большое количество гистонов, которые являются основными структурными белками ядра (суммарная масса гистонов равна массе ДНК).
Кластер генов - это группа различных генов с родственными функциями, локализованных в определённых участках хромосом. В состав кластера входят активно функционирующие гены и псевдогены (Нуклеотидные последовательности псевдогенов сходны с последовательностями функционально активных генов, но псевдогены не экспрессируются и не образуют белок. Часто кластеры являются семейством генов, произошедшим от некоего гена-предка.
Классическим примером являются гены глобина в составе А и В кластеров. Гемоглобин представлен гемом и белком тетрамером-глобином. Глобиновый тетрамер состоит из двух идентичных цепей и двух идентичных цепей. Аминокислотная последовательность каждой глобиновой цепи и кодируется своим собственным геном, входящим соответственно в состав А или В кластера. У человека А кластер располагается в 16 хромосоме, а В кластер в 11 хромосоме (рис. 20). Кластер В занимает участок ДНК размером 50 тысяч пар нуклеотидов и включает в себя пять функционально активных генов и один псевдоген: ген (эпсилон); два гена (гамма); псевдоген (бэта); ген (дельта) и ген (бэта).
Кластер А располагается более компактно и занимает участок ДНК размером более 28 тысяч пар нуклеотидов и включает в себя активный ген (дзета), псевдоген (дзета), псевдоген (альфа) и гены (альфа) два и (альфа) один, кодирующие идентичные белки. Гены глобина по внутреннему строению являются мозаичными.
Повторяющиеся гены и кластеры глобиновых генов относятся к мультигенным семейства

ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЙ БИЛЕТ № 7_____

Продуценты белка

Производство микробной биомассы - самое крупное микробиологическое производство. Микробная биомасса может быть хорошей белковой добавкой для домашних животных, птиц и рыб. Производство микробной биомассы особенно важно для стран, не культивирующих в больших масштабах сою (соевую муку используют как традиционную белковую добавку к кормам).

При выборе микроорганизма учитывают удельную скорость роста и выход биомассы на данном субстрате, стабильность при поточном культивировании, величину клеток. Клетки дрожжей крупнее, чем бактерий, и легче отделяются от жидкости при центрифугировании. Можно выращивать полиплоидные мутанты дрожжей с крупными клетками. В настоящее время известны только две группы микроорганизмов, которым присущи свойства, необходимые для крупномасштабного промышленного производства: это дрожжи рода Candida на n-алканах (нормальных углеводородах) и бактерии Methylophillus methylotrophus на метаноле.

Микроорганизмы можно выращивать и на других питательных средах: на газах, нефти, отходах угольной, химической, пищевой, винно-водочной, деревообрабатывающей промышленности. Экономические преимущества их использования очевидны. Так, килограмм переработанной микроорганизмами нефти дает килограмм белка, а, скажем, килограмм сахара - всего 500 граммов белка. Аминокислотный состав белка дрожжей практически не отличается от такового, полученного из микроорганизмов, выращенных на обычных углеводных средах. Биологические испытания препаратов из дрожжей, выращенных на углеводородах, которые проведены и у нас в стране и за рубежом, выявили полное отсутствие у них какого-либо вредного влияния на организм испытуемых животных. Опыты были проведены на многих поколениях десятков тысяч лабораторных и сельскохозяйственных животных. В непереработанном виде дрожжи содержат неспецифические липиды и аминокислоты, биогенные амины, полисахариды и нуклеиновые кислоты, а их влияние на организм пока еще плохо изучено. Поэтому и предлагается выделять из дрожжей белок в химически чистом виде. Освобождение его от нуклеиновых кислот также уже стало несложным.

В современных биотехнологических процессах, основанных на использовании микроорганизмов, продуцентами белка служат дрожжи, другие грибы, бактерии и микроскопические водоросли.

С технологической точки зрения наилучшими из них являются дрожжи. Их преимущество заключается прежде всего в "технологичности": дрожжи легко выращивать в условиях производства. Они характеризуются высокой скоростью роста, устойчивостью к посторонней микрофлоре, способны усваивать любые источники питания, легко отделяются, не загрязняют воздух спорами. Клетки дрожжей содержат до 25% сухих веществ. Наиболее ценный компонент дрожжевой биомассы - белок, который по составу аминокислот превосходит белок зерна злаковых культур и лишь немного уступает белкам молока и рыбной муки. Биологическая ценность дрожжевого белка определяется наличием значительного количества незаменимых аминокислот. По содержанию витаминов дрожжи превосходят все белковые корма, в том числе и рыбную муку. Кроме того, дрожжевые клетки содержат микроэлементы и значительное количество жира, в котором преобладают ненасыщенные жирные кислоты. При скармливании кормовых дрожжей коровам повышаются удои и содержание жира в молоке, а у пушных зверей улучшается качество меха. Интерес представляют и дрожжи, обладающие гидролитическими ферментами и способные расти на полисахаридах без их предварительного гидролиза. Использование таких дрожжей позволит избежать дорогостоящую стадию гидролиза полисахаридсодержащих отходов. Известно более 100 видов дрожжей, которые хорошо растут на крахмале как на единственном источнике углерода. Среди них особенно выделяются два вида, которые образуют как глюкоамилазы, так и β-амилазы, растут на крахмале с высоким экономическим коэффициентом и могут не только ассимилировать, но и сбраживать крахмал: Schwanniomyces occidentalis и Saccharomycopsis fibuliger. Оба вида - перспективные продуценты белка и амилолитических ферментов на крахмалсодержащих отходах. Ведутся поиски и таких дрожжей, которые могли бы расщеплять нативную целлюлозу. Целлюлазы обнаружены у нескольких видов, например у Trichosporon pullulans, однако активность этих ферментов низкая и о промышленном использовании таких дрожжей говорить пока не приходится. Дрожжи из рода Kluyveromyces хорошо растут на инулине - основном запасном веществе в клубнях топинамбура - важной кормовой культуры, которая также может быть использована для получения дрожжевого белка.

Классификация ферментов

Классификация ферментов основана на механизме их действия и включает 6 классов.

Ферменты как биокатализаторы обладают рядом уникальных свойств, например, таких как высокая каталитическая активность и избирательность действия. В ряде случаев ферменты обладают абсолютной специфичностью, катализируя превращение только одного вещества. Для каждого фермента существует свой оптимум рН, при котором его каталитическое действие максимально. При резком изменении рН ферменты инактивируются из-за необратимой денатурации. Ускорение реакции при повышении температуры также лимитировано определенными пределами, поскольку уже при температуре 40-50 о С многие ферменты денатурируют. Эти свойства ферментов приходится учитывать при разработке технологии нового препарата.

Поскольку ферменты - вещества белковой природы, в смеси с другими белками их количество определить практически невозможно. Наличие фермента в препарате может быть установлено лишь по протеканию той реакции, которую катализирует фермент. При этом количественную оценку содержания фермента можно дать, определив либо количество образовавшихся продуктов реакции, либо количество израсходовавшегося субстрата. За единицу активности фермента принимают то его количество, которое катализирует превращение одного микромоля субстрата в 1 минуту при заданных стандартных условиях - стандартная единица активности.

Основную часть ферментов, получаемых промышленным способом, составляют гидролазы. К ним относятся, в первую очередь амилолитические ферменты: α-амилаза, β-амилаза, глюкоамилаза. Их основная функция - гидролиз крахмала и гликогена. Крахмал при гидролизе расщепляется на декстрины, а затем до глюкозы. Эти ферменты применяются в спиртовой промышленности, хлебопечении.

Протеолитические ферменты образуют класс пептидгидролаз. Их действие заключается в ускорении гидролиза пептидных связей в белках и пептидах. Важная их особенность - селективный характер действия на пептидные связи в белковой молекуле. Например, пепсин действует только на связь с ароматическими аминокислотами, трипсин - на связь между аргинином и лизином. В промышленности протеолитические ферменты классифицируют по способности проявлять активность в определенной области рН:

· рН 1.5 - 3.7 - кислые протеазы;

· рН 6.5 - 7.5 - протеазы;

· pH > 8.0 - щелочные протеазы.

Протеазы находят широчайшее применение в разных отраслях промышленности:

· мясная - для смягчения мяса;

· кожевенная - смягчение шкур;

· кинопроизводство - растворение желатинового слоя при регенерации пленок;

· парфюмерная - добавки в зубную пасту, кремы, лосьоны;

· производство моющих средств - добавки для удаления загрязнений белковой природы;

· медицина - при лечении воспалительных процессов, тромбозов и т.д.

Пектолитические ферменты уменьшают молекулярную массу и снижают вязкость пектиновых веществ. Пектиназы делятся на две группы - гидролазы и трансэлиминазы. Гидралазы отщепляют метильные остатки или разрывают гликозидные связи. Трансэлиминазы ускоряют негидролитическое расщепление пектиновых веществ с образованием двойных связей. Применяются в текстильной промышленности (вымачивание льна перед переработкой), в виноделии - осветление вин, а также при консервировании фруктовых соков.

ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЙ БИЛЕТ 8

1 Назовите наиболее распространенных представителей цианобактерии? Цианобактерии, или сине-зеленые водоросли (лат. Cyanobacteria) - обширная группа грамотрицательных бактерий крупных размеров, отличительной особенностью которых является способность к фотосинтезу. Цианобактерии - это наиболее сложно устроенные и дифференцированные прокариоты. Цианобактерии распространены в морях и пресных водоемах, почвенном покрове, могут участвовать в симбиозах (лишайники). Редкие виды обладают токсичностью и условно-патогенны для человека. Сине-зеленые водоросли основные элементы, вызывающие «цветение» воды, что приводит к массовой гибели рыб, отравлениям животных и людей. Для некоторых видов характерна редкая комбинация свойств: способность к фотосинтезу и одновременно фиксации азота из атмосферного воздуха.

Цианобактерии – одноклеточные организмы, могут формировать колонии, известны нитчатые формы. Размножение осуществляется посредством бинарного деления, возможно множественное деление. Продолжительность жизненного цикла при благоприятных условиях составляет 6-12 часов.

Цианобактерии широко распространены в самых разнообразных экологических нишах по всему земному шару, за что получили название космополитных организмов. Такое широкое распространение связано с биологическими свойствами цианобактерии - специфическим метаболизмом, высокой устойчивостью к изменению таких параметров среды, как температура, влажность, освещенность, засоленность, ультрафиолетовое и радиационное облучение и т.д. Цианобактерии обитают в тундре, в снегах и льдах, в пустынях, в горячих исто чниках с температурой до 80С, в засоленных озерах и почве.

ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЙ БИЛЕТ №9

ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЙ БИЛЕТ №10

ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЙ БИЛЕТ № 11

ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЙ БИЛЕТ № 12

1. Как называют полезные бактерии? Приведите примеры таких бактерии?

Полезные бактерии относятся к эубактериям. Уксуснокислые бактерии, представленные родами Gluconobacter и Acetobacter, - это грамотрицательные бактерии, превращающие этанол в уксусную кислоту, а уксусную кислоту в углекислый газ и воду. Род Bacillus относится к грамположительным бактериям, которые способны образовывать эндоспоры и имеют перитрихиальное жгутикование. B.subtilis - строгий аэроб, а B.thuringiensis может жить и в анаэробных условиях. Анаэробные, образующие споры бактерии представлены родом Clostridium. C.acetobutylicum сбраживает сахара в ацетон, этанол, изопропанол и n-бутанол (ацетобутаноловое брожение), другие виды могут также сбраживать крахмал, пектин и различные азотсодержащие соединения.

Биотехнология - это технологические процессы с использованием биотехнологических систем - живых организмов и компонентов живой клетки. Системы могут быть разными - от микробов и бактерий до ферментов и генов. Биотехнология - это производство, основанное на достижениях современной науки: генетической инженерии, физико-химии ферментов, молекулярной диагностики и молекулярной биологии, селекционной генетики, микробиологии, биохимии, химии антибиотиков.

В сфере производства лекарственных средств биотехнология вытесняет традиционные технологии, открывает принципиально новые возможности. Биотехнологическим способом производят генно-инженерные белки (интерфероны, интерлейкины, инсулин, вакцины против гепатита и т.п.), ферменты, диагностические средства (тест-системы на наркотики, лекарственные вещества, гормоны и т.п.), витамины, антибиотики, биодеградируемые пластмассы, биосовместимые материалы.

Иммунная биотехнология, с помощью которой распознают и выделяют из смесей одиночные клетки, может применяться не только непосредственно в медицине для диагностики и лечения, но и в научных исследованиях, в фармакологической, пищевой и других отраслях промышленности, а также использоваться для получения препаратов, синтезируемых клетками защитной системы организма.

В настоящее время достижения биотехнологии перспективны в следующих отраслях:

В промышленности (пищевая, фармацевтическая, химическая, нефтегазовая) - использование биосинтеза и биотрансформации новых веществ на основе сконструированных методами генной инженерии штаммов бактерий и дрожжей с заданными свойствами на основе микробиологического синтеза;

В экологии - повышение эффективности экологизированной защиты растений, разработка экологически безопасных технологий очистки сточных вод, утилизация отходов агропромышленного комплекса, конструирование экосистем;

В энергетике - применение новых источников биоэнергии, полученных на основе микробиологического синтеза и моделированных фотосинтетических процессов, биоконверсии биомассы в биогаз;

В сельском хозяйстве - разработка в области растениеводства трансгенных агрокультур, биологических средств защиты растений, бактериальных удобрений, микробиологических методов, рекультивации почв; в области животноводства - создание эффективных кормовых препаратов из растительной, микробной биомассы и отходов сельского хозяйства, репродукция животных на основе эмбриогенетических методов;

В медицине - разработка медицинских биопрепаратов, мо-ноклональных антител, диагностикумов, вакцин, развитие иммунобиотехнологии в направлении повышения чувствительности и специфичности иммуноанализа заболеваний инфекционной и неинфекционной природы.

По сравнению с химической технологией биотехнология имеет следующие основные преимущества:

Возможность получения специфичных и уникальных природных веществ, часть из которых (например, белки, ДНК) еще не удается получать путем химического синтеза;

Проведение биотехнологических процессов при относительно невысоких температурах и давлениях;

Микроорганизмы имеют значительно более высокие скорости роста и накопления клеточной массы, чем другие организмы. Например, с помощью микроорганизмов в ферментере объемом 300 м 3 за сутки можно выработать 1 т белка (365 т/год). Чтобы такое же количество белка в год выработать с помощью крупного рогатого скота, нужно иметь стадо 30 000 голов. Если же использовать для получения такой скорости производства белка бобовые растения, например горох, то потребуется иметь поле гороха площадью 5400 га;

В качестве сырья в процессах биотехнологии можно использовать дешевые отходы сельского хозяйства и промышленности;

Биотехнологические процессы по сравнению с химическими обычно более экологичны, имеют меньше вредных отходов, близки к протекающим в природе естественным процессам;

Как правило, технология и аппаратура в биотехнологических производствах более просты и дешевы.

В качестве первоочередной задачи перед биотехнологией стоит создание и освоение производства лекарственных препаратов для медицины: интерферонов, инсулинов, гормонов, антибиотиков, вакцин, моноклональных антител и других, позволяющих осуществлять раннюю диагностику и лечение сердчено-сосудистых, злокачественных, наследственных, инфекционных, в том числе вирусных заболеваний.

Понятие "биотехнология" собирательное и охватывает такие области, как ферментационная технология, применение биофакторов с использованием иммобилизованных микроорганизмов или энзимов, генная инженерия, иммунная и белковая технологии, технология с использованием клеточных культур как животного, так и растительного происхождения.

Биотехнология - это совокупность технологических методов, в том числе и генной инженерии, использующих живые организмы и биологические процессы для производства лекарственных средств, или наука о разработке и применении живых систем, а также неживых систем биологического происхождения в рамках технологических процессов и индустриального производства.

Современная биотехнология - это химия, где изменение и превращение веществ происходит с помощью биологических процессов. В острой конкуренции успешно развиваются две химии: синтетическая и биологическая.

1. Биообъекты как средство производства лечебных, реабилитационных, профилактических и диагностических средств. Классификация и общая характеристика биообъектов.

Объектами биотехнологии являются вирусы, бактерии, грибы - микромицеты и макромицеты, протозойные организмы, клетки (ткани) растений, животных и человека, некоторые биогенные и функционалъно сходные с ними вещества (например, ферменты, простагландины, пектины, нуклеиновые кислоты и др.). Следовательно, объекты биотехнологии могут быть представлены организованными частицами (вирусы), клетками (тканями) или их метаболитами (первичными, вторичными). Даже при использовании биомолекулы как объекта биотехнологии исходный биосинтез ее осуществляется в большинстве случаев соответствующими клетками. В этой связи можно сказать, что объекты биотехнологии относятся либо к микробам, либо к растительным и животным организмам. В свою очередь организм можно образно характеризовать как систему экономного, сложнейшего, компактного, саморегулируемого и, следовательно, целенаправленного биохимического производства, устойчиво и активно протекающего при оптимальном поддержании всех необходимых параметров. Из такого определения следует, что вирусы не являются организмами, но по содержанию молекул наследственности, приспособляемости, изменчивости и некоторым другим свойствам они относятся к представителям живой природы.

Как видно из приводимой схемы, объекты биотехнологии исключительно разнообразны, диапазон их распространяется от организованных частиц (вирусов) до человека.

В настоящее время большинство объектов биотехнологии составляют микробы, относящиеся к трем надцарствам (безъядерные, предъядерные, ядерные) и пяти царствам (вирусы, бактерии, грибы, растения и животные). Причем первые два надцарства состоят исключительно из микробов.

Микробами среди растений являются микроскопические водоросли (Аlgае), а среди животных.- микроскопические простейшие (Рrotozoa). Из эукариот к микробам относятся грибы и, при определенных оговорках, лишайники, которые являются природными симбиотическими ассоциациями микроскопических грибов и микроводорослей или грибов и цианобактерий.

Аcaryotа - безъядерные, Рrосаrуоtа - предъядерные и Еuсаrуоtа - ядерные (от греч. а - нет, рrо - до, еu - хорошо, полностью, саrуоn - ядро). К первому относятея организованные частицы - вирусы и вироиды, ко второму - бактерии, к третьему - все другие организмы (грибы, водоросли, растения, животные).

Микроорганизмы образуют огромное количество вторичных метаболитов, многие из которых также нашли применение, например, антибиотики и другие корректоры гомеостаза клеток млекопитающих.

Пробиотики - препараты на основе биомассы отдельных видов микроорганизмов используются при дисбактериозах для нормализации микрофлоры желудочнокишечного тракта. Микроорганизмы необходимы также при производстве вакцин. Наконец, микробные клетки методами генной инженерии могут быть превращены в продуценты видоспецифических для человека белковых гормонов, белковых факторов неспецифического иммунитета и т.д.

Высшие растения являются традиционным и к настоящему времени все еще наиболее обширным иеточником получения лекарственных средств. При использовании растений в качестве биообъектов основное внимание сосредоточено на вопросах культивирования растительных тканей на искусственных средах (каллусные и суспензионные культуры) и открывающихся при этом новых перспективах.

2. Макробиообъекты животного происхождения. Человек как донор и объект иммунизации. Млекопитающие, птицы, рептилии и др.

В последние годы в связи с развитием технологии рекомбинантной ДНК стремительно возрастает важность такого биообъекта как человек, хотя на первый взгляд это кажется парадоксальным.

Однако биообъектом с позиций биотехнологии (при использовании биореакторов) человек стал лишь после реализации возможности клонирования его ДНК (точнее ее экзонов) в клетках микроорганизмов. За счет такого подхода был ликвидирован дефицит сырья для получения видоспецифических белков человека.

Важное значение в биотехнологии имеют макрообъекты, к которым относятся различные животные и птицы. В случае производства иммунной плазмы человек выступает, кроме того, в качестве объекта иммунизации.

Для получения различных вакцин в качестве объектов для размножения вирусов используют органы и ткани, в том числе эмбриональные, различных животных и птиц: Необходимо отметить, что термином «донор» в данном случае обозначен биообъект, поставляющий материал для процесса производства лекарственного средства без ущерба для собственной жизнедеятельности, а термином «донатор» - биообъект, у которого забор материала для производства лекарственного средства оказывается несовместимым с продолжением жизнедеятельности.

Из эмбриональных тканей наиболее широко используемыми являются эмбриональные ткани цыпленка. Особенной выгодой отличаются куриные эмбрионы (по доступности) десяти-двенадцатисуточного возраста, используемые преимущественно для репродукции вирусов и последующего изготовления вирусных вакцин. Куриные эмбрионы введены в вирусологическую практику в 1931 г. Г. М. Вудруфом и Е. У. Гудпасчером. Такие эмбрионы рекомендуют также для выявления, идентификации и определения инфицирующей дозы вирусов, для получения антигенных препаратов, применяемых в серологических реакциях.

Инкубированные при 38°С куриные яйца овоскопируют (просвечивают), отбраковывают, "прозрачные" неоплодотворенные экземпляры и сохраняют оплодотворенные, в которых хорошо видны наполненные кровеносные сосуды хорионаллантоисной оболочки и движения эмбрионов.

Заражение эмбрионов можно проводить вручную и автоматизированно. Последний способ применяют в крупномасштабном производстве, например, противогриппозных вакцин. Материал, содержащий вирусы, вводят с помощью шприца (батареи шприцов) в различные части эмбриона (эмбрионов).

Все этапы работы с куриными эмбрионами после овоскопии проводят в асептичных условиях. Материалом для заражения могут быть суспензия растертой мозговой ткани (применительно к вирусу бешенства), печени, селезенки, почек (применительно к хламидиям орнитоза) и т. д. В целях деконтаминации вирусного материала от бактерий или в целях предотвращения его бактериального загрязнения можно использовать соответствующие антибиотики, например, пенициллин с каким-либо ами-ногликозидом порядка 150 МЕ каждого на 1 мл суспензии виру-сосодержащего материала. Для борьбы с грибковым заражением эмбрионов целесообразно воспользоваться некоторыми антибио-тиками-полиенами (нистатин, амфотерицин В) или отдельными производными бензимидазола (например дактарин и др.).

Чаще всего суспензию вирусного материала вводят в аллантоисную полость или, реже, на хорионаллантоисную оболочку в количестве 0,05-0,1 мл, прокалывая продезинфицированную скорлупу (например, иодированным этанолом) на расчетную глубину. После этого отверстие закрывают расплавленным парафином и эмбрионы помещают в термостат, в котором поддерживается оптимальная температура для репродукции вируса, например 36-37,5°С. Продолжительность инкубации зависит от типа и активности вируса. Обычно через 2-4 суток можно наблюдать изменение оболочек с последующей гибелью эмбрионов. Зараженные эмбрионы контролируют ежедневно 1-2 раза (овоскопируют, поворачивают другой стороной). Погибшие эмбрионы затем передают в отделение сбора вирусного материала. Там их дезинфицируют, аллантоисную жидкость с вирусом отсасывают и переносят в стерильные емкости. Инактивацию вирусов при определенной температуре проводят обычно с помощью формалина, фенола или других веществ. Применяя высокоскоростное центрифугирование или афинную хроматографию (см.), удается получать высокоочищенные вирусные частицы.

Собранный вирусный материал, прошедший соответствующий контроль, подвергают лиофильной сушке. Контролю подлежат следующие показатели: стерильность, безвредность и специфическая активность. Применительно к стерильности имеют в виду отсутствие: живого гомологичного вируса в убитой вакцине, бактерий и грибов. Безвредность и специфическую активность оценивают на животных и только после этого вакцину разрешают испытывать на волонтерах или добровольцах; после успешного проведения клинической апробации вакцину разрешают применять в широкой медицинской практике.

На куриных эмбрионах получают, например, живую противогриппозную вакцину. Она предназначается для интраназального введения (лицам старше 16 лет и детям от 3 до 15 лет). Вакцина представляет собой высушенную аллантоисную жидкость, взятую от зараженных вирусом куриных эмбрионов. Тип вируса подбирают согласно эпидемиологической ситуации и прогнозам. Поэтому препараты могут выпускаться в виде моновакцины или дивакцины (напрмер, включающая вирусы А2 и В) в ампулах с 20 и 8 прививочными дозами для соответствующих групп населения. Высушенная масса в ампулах обычно имеет светло-желтый цвет, который сохраняется и после растворения содержимого ампулы в прокипяченой остуженной воде.

Живые противогриппозные вакцины для взрослых и детей готовят и для приема через рот. Такие вакцины представляют собой специальные вакцинные штаммы, репродукция которых происходила в течение 5-15 пассажей (не менее и не более) на культуре почечной ткани куриных эмбрионов. Их выпускают в сухом виде во флаконах. При растворении в воде цвет из светло-желтого переходит в красноватый.

Из других вирусных вакцин, получаемых на куриных эмбрионах, можно назвать противопаротитную, против желтой лихорадки.

Из прочих эмбриональных тканей используют эмбрионы мышей или других млекопитающих животных, а также абортированные плоды человека.

Эмбриональные перевиваемые ткани доступны после обработки трипсином, поскольку в таких тканях еще не формируется большого количества межклеточных веществ (в том числе небелковой природы). Клетки разделяются и после необходимых обработок их культивируют в специальных средах в монослое или в суспендированном состоянии.

Ткани, изолируемые от животных после рождения, относятся к разряду зрелых. Чем их возраст больше, тем с большим трудом они культивируются. Однако после успешного выращивания они затем "выравниваются" и мало чем отличаются от эмбриональных клеток.

Кроме полиомиелита специфическую профилактику живыми вакцинами проводят при кори. Противокоревую живую сухую вакцину изготавливают из вакцинного штамма, репродукция которого осуществлялась на клеточных культурах почек морских свинок или фибробластах японских перепелок.

3. Биообъекты растительного происхождения. Дикорастущие растения и культуры растительных клеток.

Для растений характерны: способность к фотосинтезу, наличие целлюлозы, биосинтез крахмала.

Водоросли - важный источник различных полисахаридов и других биологичоски активных веществ. Размножаются оии вегетативио, бесполым и половым путями. Как биообъекты используются недостаточно, хотя, например, ламинария под названием морской капусты производится промышленностью разлнчных стран. Хоро-шо известны агар-агар и альгинаты, получаемые из водорослей.

Клетки высших растеиий. Высшие растения (порядка 300 000 видов) - зто дифференцированные многоклеточные, преимущественно наземные организмы. Из всех тканей лишь меристематические способны к делению и за их счет образуются все другие ткани. Это важно для получения клеток, которые затем должны быть включены в биотехнологический процесс.

Клетки меристемы, задерживающиеся на эмбриоиальной стадии развития в течение всей жизни растения, называготся инициальными, другие постепенно дифференцируются и превращаются в клетки различных постоянных тканей - конечные клетки.

В зависимости от топологии в растении меристемы подразделяют на верхушечные, или апикальные (отлат. арех - верхушка), боковые, или латеральные (от лат. lateralis - боковой) и промежуточные, или интеркалярные (от лат. Intercalaris - промежугочный, вставной.

Тотипотентность - это свойство соматических клеток растений полностью реализовать свой потенциал развития вплоть до образования целого растения.

Любой вид растения может дать в соответствующих условиях неорганизованную массу делящихся клеток - каллус (отлат. callus - мозоль), особенно при индуцирующем влиянии растительных гормонов. Массовое производство каллусов с дальнейшей регенерацией побегов пригодно для крупномасштабного производства растений. Вообще каллус представляет собой основной тип культивируемой на питательной среде растительной клетки. Каллусная ткань из любого расгения может длительно рекультивироваться. При этом первоначальные растения (в том числе и меристематические), дифференцируются и деспециализируются, но индуцируются к делению, формируя первичный каллус.

Кроме выращивания каллусов удается культивировать клетки некоторых растений в суспензионных культурах. Важными биообъектами представляются также и протопласты растительных клеток. Методы их получения принципиально сходны с методами получения бактериальных и грибных протопласгов. Последующие клеточно-иижснерныс эксперименты с ними заманчивы по возможным ценным результатам.

4. Биообъекты - микроорганизмы. Основные группы получаемых биологически активных веществ.

Объектами биотехнологии являются вирусы, бактерии, грибы - микромицсты и макромицеты, протозойные организмы, клетки (ткани) растений, животных и человека, некоторые биогенные и функционалъно сходные с ними вещества (например, ферменты, простагландины, лектины, нуклеиновые кислоты и др.). Следовательно, объекты биотехнологии могут быть представлены организованными частицами (вирусы), клетками (тканями) или их метаболитами (первичными, вторичными). Даже при использовании биомолекулы как объекта биотехнологии исходный биосинтез ее осуществляется в большинстве случаев соответствующими клетками. В этой связи можно сказать, что объекты биотехнологии относятся либо к микробам, либо к растительным и животным организмам. В свою очередь организм можно образно характеризовать как систему экономного, сложнейшего, компактного, само-регулируемого и, следовательно, целенаправленного биохимиче-ского производства, устойчиво и активно протекающего при оптимальном поддержании всех необходимых параметров. Из такого определения следует, что вирусы не являются организмами, но по содержанию молекул наследственности, приспособляемости, изменчивости и некоторым другим свойствам они относятся к представителям живой природы.

В настоящее время большинство объектов биотехнологии составляют микробы, относящиеся к трем надцарствам (безъядерные, предъядерные, ядерные) и пяти царствам (вирусы, бактерии, грибы, растения и животные). Причем первые два надцарства состоят исключительно из микробов,.

Клетки грибов, водорослей, растений и животных имеют настоящее, отграниченное от цитоплазмы, ядро и поэтому их относят к эукариотам.

5. Биообъекты - макромолекулы с ферментативной активностью. Использование в биотехнологических процессах.

В последнее время группа ферментных препаратов получила новое направление применения - это инженерная энзимология, которая является разделом биотехнологии, где биообъектом выступает фермент.

Органотерапия, т.е. лечение органами и препаратами из органов, тканей и выделений животных, долгое время покоилась на глубоком эмпиризме и противоречивых представлениях, занимая видное место в медицине всех времен и народов. Лишь во второй половине XIX столетия в результате успехов, достигнутых биологической и органической химией, и развития экспериментальной физиологии органотерапия становится на научную основу. Это связано с именем французского физиолога Броун-Секара. Особое внимание привлекали работы Броун-Секара связанные с введением в организм человека вытяжек из семенников быка, оказавших положительное влияние на работоспособность и самочувствие.

Первыми официнальными препаратами (ГФ VII) были адреналин, инсулин, питуитрин, пепсин и панкреатин. В дальнейшем в результате обширных исследований, проведенных советскими эндокринологами и фармакологами, оказалось возможным последовательно расширить круг официнальных и неофицинальных органопрепаратов.

Тем не менее, некоторые аминокислоты получают химическим синтезом, например глицин, а также D-, L-метионин, D-изомер которого малотоксичен, поэтому медицинский препарат на основе метионина содержит D- и L-формы, хотя за рубежом в медицине используется препарат, содержащий только L-форму метионина. Там рацемическую смесь метионина разделяют биоконверсией D-формы в L-форму под влиянием специальных ферментов живых клеток микроорганизмов.

Иммобилизованные ферментные препараты обладают рядом существенных преимуществ при использовании их в прикладных целях по сравнению с нативными предшественниками. Во-первых, гетерогенный катализатор легко отделить от реакционной среды, что дает возможность: а) остановить в нужный момент реакцию; б) использовать катализатор повторно; в) получать продукт, не загрязненный ферментом. Последнее особенно важно в ряде пищевых и фармацевтических производств.

Во-вторых, использование гетерогенных катализаторов позволяет проводить ферментативный процесс непрерывно, например в проточных колоннах, и регулировать скорость катализируемой реакции, а также выход продукта путем изменения скорости потока.

В-третьих, иммобилизация или модификация фермента способствует целенаправленному изменению свойств катализатора, в том числе его специфичности (особенно в отношении к макромолекулярным субстратам), зависимости каталитической активности от рН, ионного состава и других параметров среды и, что очень важно, его стабильности по отношению к различного рода денатурирующим воздействиям. Отметим, что крупный вклад в разработку общих принципов стабилизации ферментов был сделан советскими исследователями.

В-четвертых, иммобилизация ферментов дает возможность регулировать их каталитическую активность путем изменения свойств носителя под действием некоторых физических факторов, таких, как свет или звук. На этой основе создаются механо- и звукочувствительные датчики, усилители слабых сигналов и бессеребряные фотографические процессы.

В результате внедрения нового класса биоорганических катализаторов - иммобилизованных ферментов, перед прикладной энзимологией открылись новые, ранее недоступные пути развития. Одно лишь перечисление областей, в которых находят применение иммобилизованные ферменты, могло бы занять немало места.

6. Направления совершенствования биообъектов методами селекции и мутагенеза. Мутагены. Классификация. Характеристика. Механизм их действия.

Что мутации - это первоисточник изменчивости организмов, создающий основу для эволюции. Однако во второй половине XIX в. для микроорганизмов был открыт еще один источник изменчивости - перенос чужеродных генов - своего рода «генная инженерия природы».

Долгое время понятие мутации относили только к хромосомам у прокариот и хромосомам (ядру) у эукариот. В настоящее время кроме хромосомных мутаций появилось также понятие мутаций цитоплазматических (плазмидных - у прокариот, митохондриальных и плазмидных - у эукариот).

Мутации могут быть обусловлены как перестройкой репликона (изменением в нем числа и порядка расположения генов), так и изменениями внутри индивидуального гена.

Применительно к любым биообъектам, но особенно часто в случае микроорганизмов, выявляются так называемые спонтанные мутации, обнаруживаемые в популяции клеток без специального воздействия на нее.

По выраженности почти любого признака клетки в микробной популяции составляют вариационный ряд. Большинство клеток имеют среднюю выраженность признака. Отклонения «+» и «–» от среднего значения встречаются в популяции тем реже, чем больше величина отклонения в любую сторону (рис. I). Первоначальный, самый простой подход к совершенствованию биообъекта заключался в отборе отклонений «+» (предполагая, что именно эти отклонения соответствуют интересам производства). В новом клоне (генетически однородное потомство одной клетки; на твердой среде - колония), полученном из клетки с отклонением «+» вновь проводился отбор по тому же принципу. Однако такая процедура при ее неоднократном повторении довольно быстро теряет эффективность, т. е. отклонения «+» становятся в новых клонах все меньше по величине.

Мутагенез осуществляется при обработке биообъекта физическими или химическими мутагенами. В первом случае, как правило, это ультрафиолетовые, гамма, рентгеновские лучи; во втором - нитрозометилмочевина, нитрозогуанидин, акридиновые красители, некоторые природные вещества (например, из ДНК–тропных антибиотиков вследствие их токсичности не применяемых в клинике инфекционных заболеваний). Механизм активности как физических, так и химических мутагенов связан с их непосредственным действием на ДНК (прежде всего на азотистые основания ДНК, что выражается в сшивках, димеризации, алкилировании последних, интеркаляции между ними).

Подразумевается, естественно, что повреждения не приводят к летальному исходу. Таким образом, после обработки биообъекта мутагенами (физическими или химическими) их воздействие на ДНК приводит к частому наследственному изменению уже на уровне фенотипа (тех или иных его свойств). Последующей задачей является отбор и оценка именно нужных биотехнологу мутаций. Для их выявления обработанную культуру высеивают на твердые питательные среды разных составов, предварительно разведя ее с таким расчетом, чтобы на твердой среде не было сплошнбго роста, а формировались отдельные колонии, образуемые при размножении именно отдельных клеток. Затем каждую колонию пересеивают и полученную культуру (клон) проверяют по тем или иным признакам в сравнении с исходной. Эта селекционная часть работы в целом весьма трудоемка, хотя приемы, позволяющие повысить ее эффективность, постоянно совершенствуются.

Так, изменяя состав твердых питательных сред, на которых вырастают колонии, можно сразу получить первоначальные сведения о свойствах клеток этой колонии в сравнении с клетками исходной культуры. Для высеивания клонов с разными особенностями метаболизма используют так называемый «метод отпечатков», разработанный Дж. Ледербергом и Э.Ледерберг. Популяцию микробных клеток разводят так, чтобы на чашке Петри с питательной средой вырастало около ста колоний и они были бы четко разделены. На металлический цилиндр диаметром, близким к диаметру чашки Петри, надевают бархат; затем все стерилизуют, создавая, таким образом, «стерильное бархатное дно» цилиндра. Далее прикладывают это дно к поверхности среды в чашке с выросшими на ней колониями. При этом колонии как бы «отпечатываются» на бархате. Затем этот бархат прикладывают к поверхности сред разного состава. Таким образом можно установить: какая из колоний в исходной чашке (на бархате расположение колоний отражает их расположение на поверхности твердой среды в исходной чашке) соответствует, например, мутанту, нуждающемуся в конкретном витамине, или конкретной аминокислоте; или какая колония соетоит из мутантных клеток, способных к образованию фермента, окисляюшего определенный субстрат; или какая колония состоит из клеток, получивших резистентность к тому или иному антибиотику и т.п.

В первую очередь биотехнолога интересуют мутантные культуры, обладающие повышенной способностью к образованию целевого продукта. Продуцент целевого вещества, наиболее перспективный в практическом отношении, может многократно обрабатываться разными мутагенами. Новые мутантные штаммы, получаемые в научных лабораториях разных стран мира, служат предметом обмена при творческом сотрудничестве, лицензионной продажи и т.п.

Потенциальные возможности мутагенеза (с последующей селекцией) обусловлены зависимостью биосинтеза целевого продукта от многих метаболических процессов в организме продуцента. Например, повышенную активность организма, образующего целевой продукт, можно ожидать, если мутация привела к дупликации (удвоению) или амплификации (умножению) структурных генов, включенных в систему синтеза целевого продукта. Далее активность можно повысить, если за счет разных типов мутаций будут подавлены функции репрессорных генов, регулирующих синтез целевого продукта. Весьма эффективный путь увеличения образования целевого продукта - нарушение системы ретроингибирования. Повысить активность продуцента можно также, изменив (за счет мутаций) систему транспорта предшественников целевого продукта в клетку. Наконец, иногда целевой продукт при резком увеличении его образования отрицательно влияет на жизнеспособность собственного продуцента (так называемый суицидный эффект). Повышение резистентности продуцента к образуемому им же веществу часто необходимо для получения, например, суперпродуцентов антибиотиков.

Помимо дупликации и амплификации структурных генов мутации могут носить характер делеции - «стирания», т.е. «выпадения» части генетического материала. Мутации могут быть обусловлены транспозицией (вставкой участка хромосомы в новое место) или инверсией (изменением порядка расположения генов в хромосоме). При этом геном мутантного организма претерпевает изменения, ведущие в одних случаях к потере мутантом определенного признака, а в других - к возникновению у него нового признака. Гены на новых местах оказываются под контролем иных регуляторных систем. Кроме того, в клетках мутанта могут появиться несвойственные исходному организму гибридные белки за счет того, что под контролем одного промотора оказываются полинуклеотидные цепи двух (или более) структурных генов, ранее отдаленных один от другого.

Немалое значение для биотехнологического производства могут иметь и так называемые «точечные» мутации. В этом случае изменения происходят впределах только одного гена. Например, выпадение или вставка одного или нескольких оснований, К «точечным» мутациям относятся трансверсия (когда происходит замена пурина на пиримидин) и транзиция (замена одного пурина на другой пурин или одного пиримидина на другой пиримидин). Замены в одной паре нуклеотидов (минимальные замены) при передаче генетического кода на стадии трансляции ведут к появлению в кодируемом белке вместо одной аминокислоты другой. Это может резко изменить конформацию данного белка и, соответственно, его функциональную активность, особенно в случае замены аминокислотного остатка в активном или аллостерическом центре.

Одним из самых блестящих примеров эффективности мутагенеза с последующей селекцией по признаку увеличения образования целевого продукта является история создания современных суперпродуцентов пенициллина. Работа с исходными биообъектами - штаммами (штамм - клоновая культура, однородность которой по определенным признакам поддерживается отбором) гриба Penicillium chrysogenum, выделенными из природных источников, велась с 1940х гг. в течение нескольких десгятилетий во многих лабораториях. Вначале некоторый успех был достигнут при отборе мутантов, появившихся в результате спонтанных мутаций. Затем перешли к индуцированию мутаций физическими и химическими мутагенами. В результате ряда удачных мутаций и ступенчатого отбора все более продуктивных мутантов активность штаммов Penicillium chrysogenum, используемых в промышленности стран, где производят пенициллин, сейчас в 100 тыс. раз выше, чем у обнаруженного А.Флемингом исходного штамма, с которого и началась история открытия пенициллина.

Производственные штаммы (применительно к биотехнологическому производству) с такой высокой продуктивностью (это относится не только к пенициллину, но и к другим целевым продуктам) крайне нестабильны вследствие того, что многочисленные искусственные изменения в геноме клеток штамма сами по себе для жизнеспособности этих клеток положительного значения не имеют. Поэтому мутантные штаммы требуют постоянного контроля при хранении: популяцию клеток высеивают на твердую среду и полученные из отдельных колоний культуры проверяют на продуктивность. При этом ревертанты - культуры с пониженной активностью отбрасывают. Реверсия объясняется обратными спонтанными мутациями, ведущими к возвращению участка генома (конкретного фрагмента ДНК) в его первоначальное состояние. Специальные ферментные системы репарации участвуют в реверсии к норме - в эволюционном механизме поддержания постоянства вида.

Совершенствование биообъектов применительно к производству не исчерпывается только повышением их продуктивности. Хотя это направление, несомненно, является главным, но оно не может быть единственным: успешная работа биотехнологического производства определяется многими факторами. С экономической точки зрения весьма важно получение мутантов, способных использовать более дешевые и менее дефицитные питательные среды. Если для работы в исследовательской лаборатории дорогие среды не создают особых финансовых проблем, то при крупнотоннажном производстве понижение их стоимости (хотя и без увеличения уровня активности продуцента) крайне важно.

Другой пример: в случае некоторых биообъектов культуральная жидкость после окончания ферментации имеет неблагоприятные в технологическом отношении реологические свойства. Поэтому в цехе выделения и очистки целевого продукта, работая с культуральной жидкостью повышенной вязкости, сталкиваются с трудностями при использовании сепараторов, фильтрпрессов и т.д. Мутации, соответствующим образом меняющие метаболизм биообъекта, в значительной мере снимают эти трудности.

Большое значение в отношении гарантии надежности производства приобретает получение фагоустойчивых биообъектов. Соблюдение асептических условий при проведении ферментации прежде всего касается предотвращения попадания в посевной материал (а также в ферментационный аппарат) клеток и спор посторонних бактерий и фибов (в более редких случаях водорослей и простейших). Предотвратить проникновение в ферментер фагов вместе с технологическим воздухом, стерилизуемым путем фильтрации, крайне трудно. Не случайно вирусы в первые годы после их открытия именовали «фильтрующимися». Поэтому основной путь борьбы с бактериофагами, актинофагами и фагами, поражающими грибы, - получение устойчивых к ним мутантных форм биообъектов.

Не касаясь специальных случаев работы с биообъектами–патогенами, следует подчеркнуть, что иногда задача совершенствования биообъектов исходит из требований промышленной гигиены. Например, выделенный из природного источника продуцент одного из важных беталактамных антибиотиков в значительном количестве образовывал летучие вешества с неприятным запахом гниющих овощей.

Мутации, ведущие к удалению генов, кодирующих ферменты, участвующие в синтезе этих летучих веществ, приобрели в данном случае практическое значение для производства.

Из всего изложенного следует, что современный биообъект, используемый в биотехнологической промышленности, - это суперпродуцент, отличающийся от исходного природного штамма не по одному, а, как правило, по нескольким показателям. Хранение таких штаммов–суперпродуцентов представляет серьезную самостоятельную проблему. При всех способах хранения их необходимо периодическй пересеивать и проверять как на продуктивность, так и на другие важные для производства свойства.

В случае применения высших растений и животных в качестве биообъектов для получения лекарственных средств возможности использования мутагенеза и селекции для их совершенствования ограничены. Однако в принципе мутагенез и селекция здесь не исключены. Особенно это относится к растениям, образующим вторичные метаболиты, которые используются как лекарственные вещества.

7. Направления создания новых биообъектов методами генетической инженерии. Основные уровни генетической инженерии. Характеристика.

С помощью методов генетической инженерии можно конструировать по определенному плану новые формы микроорганизмов, способных синтезировать самые различные продукты, в том числе продукты животного и растительного происхождения, При этом следует учитывать высокие скорости роста и продуктивность микроорганизмов, их способность к утилизации разнообразных видов сырья. Широкие перспективы перед биотехнологией открывает возможность микробиологического синтеза белков человека: таким способом получены соматостатин, интерфероны, инсулин, гормон роста.

Основные проблемы на пути конструирования новых микроорганизмов-продуцентов сводятся к следующему.

1. Продукты генов растительного, животного и человеческого происхождения попадают в чуждую для них внутриклеточную среду, где они подвергаются разрушению микробными протеаза-ми. Особенно быстро, за несколько минут, гидролизуются короткие пептиды типа соматостатина. Стратегия защиты генноинженерных белков в микробной клетке сводится к: а) использованию ингибиторов протеаз; так, выход человеческого интерферона возрастал в 4 раза при введении в плазмиду, несущую интерфе-роновый ген, фрагмента ДНК фага Т4 с геном pin, отвечающим за синтез ингибитора протеаз; б) получению интересующего пептида в составе гибридной белковой молекулы, для этого ген пептида сшивают с природным геном организма-реципиента; чаще всего используют ген белка А Staphylococcus aureus\ в) амплификации (увеличению числа копий) генов; многократное повторение гена человеческого проинсулина в составе плазмиды привело к синтезу в клетке Е. coli мультимера этого белка, который оказался значительно стабильнее к действию внутриклеточных протеаз, чем мономерный проинсулин. Проблема стабилизации чужеродных белков в клетках исследована еще недостаточно (В. И. Таняшин, 1985).

2. В большинстве случаев продукт трансплантированного гена не высвобождается в культуральную среду и накапливается внутри клетки, что существенно затрудняет его выделение. Так, принятый метод получения инсулина с помощью Е. coli предполагает разрушение клеток и последующую очистку инсулина. В связи с этим большое значение придается трансплантации генов, отвечающих за экскрецию белков из клеток. Имеются сведения о новом способе генноинженерного синтеза инсулина, который выделяется в культуральную среду (М. Sun, 1983).

Оправдана также переориентация биотехнологов с излюбленного объекта генетической инженерии Е. coli на другие биообъекты. Е. coli экскретирует сравнительно мало белков. Кроме того, клеточная стенка этой бактерии содержит токсическое вещество эндокотин, которое необходимо тщательно отделять от продуктов, используемых в фармакологических целях. Как объекты генетической инженерии перспективны поэтому грамположительные бактерии (представители родов Bacillus, Staphylococcus, Streptomyces). В частности Bas. subtilis выделяет более 50 различных белков в культуральную среду (С. Vard, 1984). В их число входят ферменты, инсектициды, а также антибиотики. Перспективны также эукариотические организмы. Они обладают рядом преимуществ, в частности, дрожжевой интерферон синтезируется в гликолизированной форме, как и нативный человеческий белок (в отличие от интерферона, синтезируемого в клетках Е. coti).

3. Большинство наследственных признаков кодируется несколькими генами, и генноинженерная разработка должна включать стадии последовательной трансплантации каждого из генов. Примером реализованного многогенного проекта является создание штамма Pseudomonas sp., способного утилизировать сырую нефть. С помощью плазмид штамм последовательно обогащался генами ферментов, расщепляющих октан, камфору, ксилол, нафталин (В. Г. Дебабов, 1982). В некоторых случаях возможна не последовательная, а одновременная трансплантация целых блоков генов с помощью одной плазмиды. В составе одной плазмиды может быть перенесен в клетку-реципиент nif-оперон Klebsiella pneumonia, отвечающий за фиксацию азота. Способность организма к фиксации азота определяется наличием по меньшей мере 17 различных генов, отвечающих как за структурные компоненты нитрогеназного комплекса, так и за регуляцию их синтеза.

Генетическая инженерия растений осуществляется на орга-низменном, тканевом и клеточном уровнях. Показанная, пусть для немногих видов (для томатов, табака, люцерны), возможность регенерации целого организма из одиночной клетки резко повысила интерес к генетической инженерии растений. Однако здесь, помимо чисто технических, предстоит решить проблемы, связанные с нарушениями структуры генома (изменения плоид-ности, хромосомные перестройки) культивируемых клеток растений. Примером реализованного генноинженерного проекта является синтез фазеолина, запасного белка фасоли, в регенерированных растениях табака. Трансплантация гена, отвечающего за синтез фазеолина, была проведена с использованием Ti-плазмиды в качестве вектора. С помощью Ti-плазмиды трансплантирован также ген устойчивости к антибиотику неомицину в растения табака, а с помощью CMV-вируса - ген устойчивости к ингибитору дигидрофолатредуктазы метотрексату в растения репы.

Генетическая инженерия растений включает манипуляции не только с ядерным геномом клеток, но также с геномом хлоро-пластов и митохондрий. Именно в хлоропластный геном наиболее целесообразно вводить ген азотфиксации для устранения потребности растений в азотных удобрениях. В митохондриях кукурузы найдены две плазмиды (S-1 и S-2), обусловливающие цитоплаз-матическую мужскую стерильность. Если селекционерам необходимо «запретить» самоопыление кукурузы и допустить лишь перекрестное опыление, они могут не заботиться об удалении тычинок вручную, если берут для оплодотворения растения с цитоплазматической мужской стерильностью. Такие растения могут быть выведены путем длительной селекции, однако генетическая инженерия предлагает более быстрый и целенаправленный метод - прямое введение плазмид в митохондрии клеток кукурузы. К разработкам в области генетической инженерии растений следует отнести также генетическую модификацию симбионтов растений - клубеньковых бактерий рода Rhizobium. В клетки этих бактерий с помощью плазмид предполагается вводить hup (hydrogen uptake)-ген, в природе существующий лишь у некоторых штаммов R. japonicum и R. leguminosarum. Нир-ген обусловливает поглощение и утилизацию газообразного водорода, высвобождаемого при функционировании азотфиксирующего ферментного комплекса клубеньковых бактерий. Рециклизаиия водорода позволяет избежать потерь восстановительных эквивалентов при симбиотической азотфиксации в клубеньках бобовых растений и значительно повысить продуктивность этих растений.

Отдаленной задачей пока остается применение методов генетической инженерии для улучшения пород сельскохозяйственных животных. Речь идет об увеличении эффективности использования кормов, повышении плодовитости, выхода молока и яиц, устойчивости животных к заболеваниям, ускорении их роста, улучшении качества мяса. Однако до сих пор не выяснена генетика всех этих признаков сельскохозяйственных животных, что препятствует попыткам генетических манипуляций в этой области.

8. Клеточная инженерия и ее использование в создании микроорганизмов и клеток растений. Метод слияния протопластов.

Клеточная инженерия - одно из наиболее важных направлений в биотехнологии. Она основана на использовании принципиально нового объекта - изолированной культуры клеток или тканей эукариотических организмов, а также на тотипотентности - уникальном свойстве растительных клеток. Применение этого объекта раскрыло большие возможности в решении глобальных теоретических и практических задач. В области фундаментальных наук стало осуществимым исследование таких сложных проблем, как взаимодействие клеток в тканях, клеточная дифференцировка, морфогенез, реализация тотипотентности клеток, механизмы появления раковых клеток и др. При решении практических задач основное внимание уделяется вопросам селекции, получения зна чительных количеств биологически ценных метаболитов растительного происхождения, в частности более дешевых лекарств, а также выращивания оздоровленных безвирусных растений, их клонального размножения и др.

В 1955 г. после открытия Ф. Скугом и С. Миллером нового класса фитогормонов - цитокининов - оказалось, что при совместном их действии с другим классом фитогормонов - ауксинами - появилась возможность стимулировать деление клеток, поддерживать рост каллусной ткани, индуцировать морфогенез в контролируемых условиях.

В 1959 г. был предложен метод выращивания больших масс клеточных суспензий. Важным событием стала разработка Е. Коккингом (Ноттингемский университет, Великобритания) в 1960 г. метода получения изолированных протопластов. Это послужило толчком к получению соматических гибридов, введению в протопласты вирусных РНК, клеточных органелл, клеток прокариот. В это же время Дж. Морелом и Р. Г. Бутенко был предложен метод клонального микроразмножения, который сразу же нашел широкое практическое применение. Весьма важным достижением в развитии технологий культивирования изолированных тканей и клеток стало культивирование одиночной клетки с помощью ткани«няньки». Этот мстод был разработан в России в 1969 г. в Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН под руководством Р. Г. Бутенко. В последние десятилетия продолжается быстрый прогресс технологий клеточной инженерии, позволяющих значительно облегчить селекционную работу. Большие успехи достигнуты в развитии методов получения трансгенных растений, технологий использования изолированных тканей и клеток травянистых растений, начато культивирование тканей древесных растений.

Впервые термин «изолированные протопласты» был предложен Д. Ханстейном в 1880 г. Протопласт в целой клетке можно наблю-дать во время плазмолиза. Изолированный протопласт - это содержимое растительной клетки, окруженное плазмалеммой. Целлюлозная стенка у данного образования отсутствует. Изолированные протопласты - одни из наиболее ценных объектов в биотехнологии. Они позволяют исследовать различные свойства мембран, а также транспорт веществ через плазмалемму. Главное их преиму-щество состоит в том, что в изолированные протопласты достаточно легко вводить генетическую информацию из органелл и клеток других растений, прокариотических организмов и из клеток животных. Е. Коккинг установил, что изолированный протопласт благодаря механизму пиноцитоза способен поглощать из окружающей среды не только низкомолекулярные вещества, но и крупные моле-кулы, частицы (вирусы) и даже изолированные органеллы.

Большое значение в создании новых форм растений для изуче-ния взаимодействия ядерного генома и геномов органелл имеет способность изолированных протопластов сливаться, образуя гибридные клетки. Таким способом можно добиться получения гибридов от растений с разной степенью таксономической удален-ности, но обладающих ценными хозяйственными качествами.

Впервые протопласты были выделены Дж. Клернером в 1892 г. при изучении плазмолиза в клетках листа телореза {Stratiotes aloides) во время механического повреждения ткани. Поэтому этот метод назван механическим. Он позволяет выделить лишь небольшое количество протопластов (вьщеление возможно не из всех видов тканей); сам метод длительный и трудоемкий. Современный метод выделения протопластов заключается в удалении клеточной стенки с помощью поэтапного использования ферментов для ее разрушения: целлюлазы, гемицеллюлазы, пектиназы. Этот метод получил название ферментативного.

Первое успешное выделение протопластов из клеток высших растений данным методом сделано Е. Коккингом в 1960 г. По сравнению с механическим ферментативный метод имеет ряд преимуществ. Он позволяет сравнительно легко и быстро выделять большое количество протопластов, причем они не испытывают сильного осмотического шока. После действия ферментов смесь протопластов пропускают через фильтр и центрифугируют для удаления неразрушенных клеток и их осколков.

Выделить протопласты можно из клеток растительных тканей, культуры каллусов и суспензионной культуры. Оптимальные условия для изоляции протопластов для разных объектов индивидуальны, что требует кропотливой предварительной работы по подбору концентраций ферментов, их соотношения, времени обработки. Очень важным фактором, позволяющим выделять целые жизнеспособные протопласты, является подбор осмотического стабилизатора. В качестве стабилизаторов обычно используют различные сахара, иногда ионные осмотики (растворы солей СаС1 2 , Na 2 HP0 4 , КСІ). Концентрация осмотиков должна быть немного гипертонична, чтобы протопласты находились в состоянии слабого плазмолиза. В этом случае тормозятся метаболизм и регенерация клеточной стенки.

Изолированные протопласты можно культивировать. Обычно для этого используют те же среды, на которых растут изолированные клетки и ткани. Сразу же после удаления ферментов у протопластов в культуре начинается образование клеточной стенки. Протопласт, регенерировавший стенку, ведет себя как изолированная клетка, способен делиться и формировать клон клеток. Регенерация целых растений из изолированных протопластов сопряжена с рядом трудностей. Получить регенерацию через эмбриогенез удалось пока только у растений моркови. Стимуляцией последовательного образования корней и побегов (органогенез) добились регенерации растений табака, петунии и некоторых других растений. Следует отметить, что протопласты, изолированные из генетически стабильной клеточной культуры, чаще регенерируют растения и с большим успехом используются при исследованиях генетической модификации протопластов.

9. Методы клеточной инженерии применительно к животным клеткам. Гибридомная технология и ее использование в биотехнологических процессах.

В 1975 г. Г. Келер и К. Мильштейн сумели впервые выделить клоны клеток, способные секретировать только один тип молекул антител и в то же время расти в культуре. Эти клоны клеток были получены слиянием антителообразующих и опухолевых клеток - клеток–химер, названных гибридомами, так как, с одной стороны, они наследовали способность к практически неограниченному росту в культуре, а с другой стороны, способность к продукции антител определенной специфичности (моноклональных антител).

Весьма существенно для биотехнолога то, что отобранные клоны могут длительно храниться в замороженном состоянии, поэтому в случае необходимости можно взять определенную дозу такого клона и ввести животному, у которого будет развиваться опухоль, продуцирующая моноклональные антитела заданной специфичности. Вскоре в сыворотке животного будут обнаружены антитела в очень высокой концентрации от 10 до 30 мг/мл. Клетки такого клона можно также выращивать in vitro, а секретируемые ими антитела получатъ из культуральной жидкости.

Создание гибридом, которые можно хранить в замороженном состоянии (криоконсервирование), позволило организовать целые гибридомные банки, что в свою очередь открыло большие перспективы по применению моноклональных антител. Сфера их применения помимо количественного определения разных веществ включает самую разнообразную диагностику, например идентификацию определенного гормона, вирусных или бактериальных антигенов, антигенов группы крови и тканевых антигенов.

Этапы получения гибридных клеток. Слиянию клеток предшествует установление тесного контакта между плазматическими мембранами. Этому препятствует наличие поверхностного заряда на природных мембранах, обусловленного отрицательно заряженными группами белков и липидов. Деполяризация мембран переменным электрическим или магнитным полем, нейтрализация отрицательного заряда мембран с помощью катионов способствует слиянию клеток. На практике широко используются ионами Са2+, хлорпромазином. Эффективным «сливающим» (фузогенным) агентом служит полиэтиленгликоль.

По отношению к животным клеткам применяют также вирус Сендай, действие которого как сливающего агента, по-видимому, связано с частичным гидролизом белков цитоплазматической мембраны. Участок субъединицы FI вируса обладает протеолитической активностью (С. Nicolau et al., 1984). Растительные, грибные и бактериальные клетки перед слиянием освобождают от клеточной стенки, при этом получаются протопласты. Клеточную стенку подвергают ферментативному гидролизу, применяя лизоцим (для бактериальных клеток), зимолиазу улитки (для клеток грибов), комплекс циллюлаз, гемицеллюлаз и пектиназ, продуцируемый грибами (для клеток растений). Набухание и последующее разрушение протопластов предотвращается созданием повышенной осмолярности среды. Подбор гидролитических ферментов и концентрации солей в среде с целью обеспечения максимального выхода протопластов представляет собой сложную задачу, решаемую в каждом случае отдельно.

Для скрининга полученных гибридных клеток используют различные подходы: 1) учет фенотипических признаков; 2) создание селективных условий, в которых выживают лишь гибриды, объединившие геномы родительских клеток.

Возможности метода слияния клеток. Метод слияния соматических клеток открывает перед биотехнологией значительные перспективы.

1. Возможность скрещивания филогенетически отдаленных форм живого. Путем слияния клеток растений получены плодовитые, фенотипически нормальные межвидовые гибриды табака, картофеля, капусты с турнепсом (эквивалентные природному рапсу), петунии. Имеются стерильные межродовые гибриды картофеля и томата, стерильные межтрибные гибриды арабидопсиса и турнепса, табака и картофеля, табака и беладонны, которые образуют морфологически ненормальные стебли и растения. Получены клеточные гибриды между представителями различных семейств, существующие, однако, лишь как неорганизованно растущие клетки (табака и гороха, табака и сои, табака и конских бобов). Получены межвидовые (Saccharomyces uvarum и S. diastalicus) и межродовые (Kluyveromyces lactis и S. cerevisiae) гибриды дрожжей. Имеются данные о слиянии клеток различных видов грибов и бактерий.

Несколько курьезными представляются опыты по слиянию клеток организмов, относящихся к различным царствам, например клеток лягушек Xenopus taevis и протопластов моркови. Гибридная растительно-животная клетка постепенно одевается клеточной стенкой и растет на средах, на которых культивируют растительные клетки. Ядро животной клетки, по-видимому, достаточно быстро теряет свою активность (Е. С. Cocking, 1984).

2. Получение асимметричных гибридов, несущих полный набор генов одного из родителей и частичный набор другого родителя. Такие гибриды часто возникают при слиянии клеток организмов, филогенетически удаленных друг от друга. В этом случае вследствие неправильных делений клеток, обусловленных некоординированным поведением двух разнородных наборов хромосом, в ряду поколений теряются частично или полностью хромосомы одного из родителей.

Асимметричные гибриды бывают устойчивее, плодовитее и жизнеспособнее, чем симметричные, несущие полные наборы генов родительских клеток. В целях асимметричной гибридизации возможна избирательная обработка клеток одного из родителей для разрушения части его хромосом. Возможен прицельный перенос из клетки в клетку нужной хромосомы. Представляет также интерес получение клеток, у которых гибридной является только цитоплазма. Цитоплазматические гибриды образуются, когда после слияния клеток ядра сохраняют свою автономию и при последующем делении гибридной клетки оказываются в разных дочерних клетках. Скрининг таких клеток проводится по генам-маркерам ядерного и цитоплазматических (митохондриального и хлоропластного) геномов.

Клетки со слившейся цитоплазмой (но не ядрами) содержат ядерный геном одного из родителей и в то же время совмещают Цитоплазматические гены слившихся клеток. Есть указания на рекомбинацию ДНК митохондрий и хлоропластов в гибридных клетках.

Получение гибридов путем слияния трех и более родительских клеток. Из таких гибридных клеток могут быть выращены растения (грибы)-регенеранты.

Гибридизация клеток, несущих различные программы развития, - слияние клеток различных тканей или органов, слияние нормальных клеток с клетками, программа развития которых изменена в результате злокачественного перерождения. В этом случае получаются так называемые гибридомные клетки, или гибридомы, наследующие от нормальной родительской клетки способность к синтезу того или иного полезного соединения, а от злокачественной - способность к быстрому и неограниченному росту.

Гибридомная технология. Получение гибридом на сегодняшний день - наиболее перспективное направление клеточной инженерии. Основная цель - «обессмертить» клетку, продуцирующую ценные вещества путем слияния с раковой клеткой и клонирования полученной гибридомной клеточной линии. Гибридомы получены на основе клеток - представителей различных царств живого. Слияние клеток растений, растущих в культуре обычно медленно, с клетками растительных опухолей позволяет получить клоны быстрорастущих клеток - продуцентов нужных соединений. Многообразны применения гибридомной технологии к животным клеткам, где с ее помощью планируется получение неограниченно размножающихся продуцентов гормонов и белковых факторов крови, Наибольшее практическое значение имеют гибридомы - продукты слияния клеток злокачественных опухолей иммунной системы (миелом) с нормальными клетками той же системы-лимфоцитами.

При попадании в организм животного или человека чужеродного агента - бактерий, вирусов, «чужих» клеток или просто сложных органических соединений - лимфоциты мобилизуются для обезвреживания введенного агента. Имеется несколько популяций лимфоцитов, функции которых различаются. Существуют так называемые Т-лимфоциты, среди которых выделяются Т-киллеры («убийцы»), непосредственно атакующие чужеродный агент с целью его инактивации, и В-лимфоциты, основная функция которых состоит в продукции иммунных белков (иммуноглобулинов), обезвреживающих чужеродный агент путем связывания с его поверхностными участками (антигенными детерминантами), иными словами, В-лимфоциты вырабатывают иммунные белки, представляющие собой антитела к чужеродному агенту - антигену.

Слияние Т-лимфоцита-киллера с опухолевой клеткой дает клон неограниченно размножающихся клеток, выслеживающих определенный антиген - тот, к которому был специфичен взятый Т-лимфоцит. Подобные Т-киллерные гибридомные клоны пытаются использовать для борьбы с раковыми клетками непосредственно в организме больного (Б. Фукс и др., 1981; 1983),

При слиянии В-лимфоцита с миеломной клеткой получаются В-гибридомные клоны, широко применяемые как продуценты антител, нацеленных на тот же антиген, что и антитела, синтезируемые породившим клон В-лимфоцитом, т. е. моноклопальных антител. Моноклональные антитела однородны по своим свойствам, они обладают одинаковым сродством к антигену и связываются с. одной единственной антигенной детерминантой. В этом состоит важное преимущество моноклональных антител - продуктов В-гибридом, по сравнению с антителами, получаемыми без применения клеточной инженерии, путем иммунизации лабораторного животного избранным антигеном с последующим выделением антител из сыворотки его крови или в результате непосредственного взаимодействия антигена с популяцией лимфоцитов в культуре ткани. Подобные традиционные методы дают смесь антител, различных по специфичности и сродству к антигену, что объясняется участием в выработке антител многих различных клонов В-лимфоцитов и наличием у антигена нескольких детерминант, каждая из которых соответствует особому типу антител. Таким образом, моноклональные антитела избирательно связываются лишь с одним антигеном, инактивируя его, что имеет большое практическое значение для распознавания и лечения заболеваний, вызываемых чужеродными агентами - бактериями, грибками, вирусами, токсинами, аллергенами и трансформированными собственными клетками (раковые опухоли), Моноклональные антитела успешно применяют в аналитических целях для изучения клеточных органелл, их структуры или отдельных биомолекул.

До недавнего времени для гибридизации использовали исключительно миеломные клетки и В-лимфоциты мыши и крысы. Продуцируемые ими моноклональные антитела имеют ограниченное терапевтическое применение, так как они сами представляют чужеродный белок для человеческого организма. Освоение технологии получения гибридом на основе иммунных клеток человека связано со значительными трудностями: человеческие гиб-ридомы растут медленно, сравнительно мало стабильны. Однако уже получены гибридомы человека - продуценты моноклональ-ных антител. Оказалось, что и человеческие моноклональные антитела в некоторых случаях вызывают иммунные реакции, и их клиническая эффективность зависит от правильного подбора класса антител, гибридомных линий, подходящих для данного больного. К достоинствам человеческих моноклональных антител относится способность распознавать тонкие различия в структуре антигена, которые не распознаются моноклональными антителами мыши или крысы. Предприняты попытки получения химерных гибридом, сочетающих мышиные миеломные клетки и человеческие В-лимфоциты; такие гибридомы находят пока лишь ограниченное применение tK- Haron, 1984).

Наряду с несомненными преимуществами моноклональные антитела имеют и недостатки, порождающие проблемы при их практическом использовании. Они не стабильны при хранении в высушенном состоянии, в то же время в смеси обычных (поли-клональных) антител всегда присутствует группа антител, устойчивая при избранных условиях хранения. Таким образом, неоднородность обычных антител дает им дополнительный резерв стабильности при изменении внешних условий, что соответствует одному из основных принципов повышения надежности систем. Моноклональные антитела нередко имеют слишком низкое сродство к антигену и чрезмерно узкую специфичность, что препятствует их применению против изменчивых антигенов, характерных для инфекционных агентов и опухолевых клеток. Необходимо отметить также очень высокую стоимость моноклональных антител на международном рынке.

Общая схема получения гибридом на основе миеломных клеток и иммунных лимфоцитов включает следующие этапы.

1. Получение мутантных опухолевых клеток, погибающих при последующей селекции гибридомных клеток. Стандартным подходом является выведение линий миеломных клеток, не способных к синтезу ферментов запасных путей биосинтеза пуринов и пиримидинов из гипоксантина и тимидина соответственно (рис 6). Отбор таких мутантов опухолевых клеток проводят с применением токсических аналогов гипоксантина и тимидина. В среде, содержащей эти аналоги, выживают только мутантные клетки, которые лишены ферментов гипоксантингуанинфосфори-бозилтрансферазы и тимидинкиназы, необходимых для запасных путей биосинтеза нуклеотидов.

Получение лифмоцитов - продуцентов антител к заданным антигенам. Животное (мышь, реже крысу, кролика) иммунизируют введением антигена в брюшную полость, внутривенно или подкожно. Для получения человеческих гибридом прибегают к иммунизации лимфоцитов человека в культуре ткани, что является более сложной и